[发明专利]一种猪冷冻精液保藏方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物生产和繁殖领域，具体地说涉及一种猪冷冻精液保藏方法。

背景技术

人工授精技术是动物繁殖中提高雄性动物繁殖力的一个关键技术。猪人工授精技术中的常用精液为常温保存的液态精液，其保存时间3-5天，最多不超过10天；如能应用冷冻技术，那公猪的利用力则能大幅度提高。目前，在牛上，特别是奶牛上，冷冻技术的研究和应用非常成熟和普遍，并有专门的国家标准，如《牛冷冻精液》(GB4143-2008)、《牛冷冻精液生产技术规程》(NY/T1234-2006)。猪和牛繁殖生理的不同，如精液量、精子密度、精液成分等，导致冷冻技术在两者上应用面的差异。目前，猪冷冻精液技术，缺乏统一的国家标准或行业标准，尚处于研究阶段，其制作工艺流程还处在摸索阶段，大多研究主要集中在稀释液成分、甘油浓度、稀释方法、剂量等方面。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种对猪新鲜精液进行稀释、抗冷处理、筛选并分装冷冻的保藏方法，以获得100％精液合格率，高精子活力的冻精产品。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种猪冷冻精液保藏方法，包括如下步骤：对采集精液稀释后降温到17℃，测量精子密度，离心后测量上清液精子密度，等温下加入冷却保护液稀释，稀释液计算公式为式(I)所示：

稀释液总量＝(稀释后精子密度-上清液精子密度)×体积/7亿    (I)，

进一步降温到4～5℃，再加入冷冻保护液进封装冷藏；根据冷冻曲线降温恒定到-120℃后，储藏在液氮罐中；所述冷冻曲线的过程是：从4～5℃以2℃/min的降温速度降温至-5℃，再以60℃/min降温速度降温至-140℃，然后回到-120℃维持10min。

采集精液的稀释步骤为：取1000ml无菌双蒸水水浴锅中加热至30～38℃，再加入原精稀释液粉

溶解获得原精稀释液，稳定1小时待用；采集精液、原精稀释液按1∶0.5的比例等温稀释，放入17℃冰箱中平衡40分钟。

稀释后精液降温到17℃后立即进行离心，17℃等温环境下，800g离心12.5min，并吸除上清液。

加冷却保护液稀释后的体积为最终体积的一半，加完稀释液后，于4℃环境下降温平衡，1h后水杯中加冰块或周围加冰袋促使其快速降温至4-5℃；0.5h后等量等温加入冷冻保护液，加入后平衡45分钟装管。

封装时利用细管容纳冷藏精液，水平放置，封口后将管内气泡晃动到管中央。

冷冻采用将容纳有冷冻精液的细管置于液氮上方的方式，通过控制与液氮液面的距离，在-80℃～-120℃之间调节，8min后投入液氮获得冻精。

有益效果：本发明所述方法中，猪用冷冻精液需在无菌的环境下操作，每一步都需严格控制，严防出错，否则会影响最终结果。本工艺中的每一环节和参数都是经过大量试验进行校正和优化。本工艺制作的冷冻精液合格率达100％，即冷冻精液解冻后精子活力在0.3以上。

具体实施方式

实施例1

(一)准备工作：

原精稀释液：取1000ml无菌双蒸水置30～38℃水浴锅中调至30～38℃，溶解原精稀释液粉47g，然后稳定1小时待用。原精稀释液粉来自Minitube公司下的产品Androhep PRO Plus Extender，产品批号13533/3009；

冷却保护液：用400ml30～38℃双蒸水溶解44g药品A；使用时，加入100g新鲜蛋黄，用磁力搅拌器搅拌30min；然后冷却到17℃备用。

冷冻保护液：用370ml32～38℃双蒸水溶解40.7g药品B。使用时，加入100g新鲜蛋黄，加入30ml甘油，用磁力搅拌器搅拌30min。然后冷却到5℃备用。或取冷却保护液185ml加入15ml甘油，用磁力搅拌器搅拌30min。然后冷却到5℃备用。

配制冷却保护液中药品A的和冷冻保护液中的药品B来自Minitube公司下产品Androhep CryoGuard Cooling&Freezing Extender，产品批号13533/2006。

(二)具体操作：

步骤1：精液采集和处理

精液采集：按规范操作。注意各个体间不要混杂。多个体使用同一集精杯时，用完后要先用蒸馏水冲洗再用38℃生理盐水冲洗干净。或在集精杯中套入一保鲜袋，每头猪换一个。

原精液稀释：采集精液、原精稀释液按1∶0.5的比例等温(一般30-35℃，根据不同季节采集到的原精温度而定)稀释。放入17℃冰箱中平衡40分钟。