[发明专利]检测Ppm1d基因多态突变位点的引物和方法

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测Ppm1d基因多态突变热点的引物，采用普通PCR技术和Sanger测序，可用于快速检测癌症患者体内Ppm1d基因多态位点的突变情况。

背景技术

Ppm1d基因位于人类第17号染色体上，总长66097bp，共有6个外显子。Ppm1d基因编码的是一种称为蛋白磷酸酶1D(PPM1D)的酶类。PPM1D属于PP2C家族，具有丝氨酸/苏氨酸酶活性。PPM1D是DNA损伤应答中的调控因子，对几个重要的细胞周期检查点包括ATM，CHK等有去磷酸化作用。因此PPM1D功能的行使对环境压力诱导的凋亡起到重要的作用。

人的PPM1D蛋白主要有两个主要区域：N端为高度保守的磷酸酶区，C端为无催化区，但C端序列是蛋白质和多肽的重要结构与功能部位，对蛋白质的生物功能甚至起决定性作用。有研究报道，Ppm1d的6号外显子发生的截断突变具有促进肿瘤细胞生长的功能。这可能是由于6号外显子的突变使PPM1D的C端部分缺失，从而使PPM1D蛋白的磷酸酶功能高活性化，增强对DNA损伤检验蛋白CHK2激活功能的抑制，阻碍癌细胞灭亡。中国每年新增300多万癌症患者，大多数采用放疗和化疗进行治疗，而部分患者对这种治疗方案具有抗性，这可能就与之前报道的Ppm1d基因的截断突变相关。当基因发生这种突变的时候，放疗和化疗不仅没有好的治疗效果，还增加病人的负担。

目前，发现的Ppm1d突变中有功能性增强突变的多发生于PPM1D的C端，本发明中所检测的两个热点突变C478X(1434C>A)和E525X(1573G>T)均为6号外显子上的截断突变，其中478位的突变与乳腺浸润性癌相关，而525位突变更是与多种癌症相关，包括子宫内膜样癌和脑胶质瘤。

分子检测的样本通常是血液样本或用石蜡包埋的病理组织样本。由于石蜡中的组织经过甲醛固定、酒精脱水等步骤后，组织中的DNA会出现不同程度的断裂、降解，并且断裂和降解又是随机的。因此针对石蜡包埋样本的检测时，引物的设计就比较重要，它会影响石蜡组织中DNA的扩增效果。

目前检测Ppm1d基因突变的方法是：提取样本中的RNA，将其逆转录为cDNA后测序。采用该检测方法需进行逆转录，无法实现石蜡包埋样本中的基因扩增。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测Ppm1d基因多态突变热点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测癌症患者体内Ppm1d基因多态位点的突变情况。所述检测Ppm1d基因多态热点突变情况的引物，包括：

扩增Ppm1d基因的引物，其碱基序列为：

Ppm1d-6-1-F：GCCTAATATCACATGCATAGATTTG

Ppm1d-6-1-R：GGCTGAGCACCACTACTTCG

进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

检测Ppm1d基因的测序引物碱基序列为：

Ppm1d-6-1-F：GCCTAATATCACATGCATAGATTTG

Ppm1d-6-1-R：GGCTGAGCACCACTACTTCG

进一步地，引物序列I Ppm1d-6-1-F和Ppm1d-6-1-R是扩增Ppm1d基因包含第478位及525位氨基酸序列的引物。

本发明还提供了检测Ppm1d基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤：

1.抽提血液/石蜡切片中的组织DNA；

2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；

3.对步骤2中的扩增产物进行测序；

4.对测序结果进行判断，确定Ppm1d基因是否发生突变；

其中PCR扩增引物为：

扩增Ppm1d基因的引物，其碱基序列为：

Ppm1d-6-1-F：GCCTAATATCACATGCATAGATTTG

Ppm1d-6-1-R：GGCTGAGCACCACTACTTCG

进一步地，测序引物碱基序列为：

检测Ppm1d基因的测序引物碱基序列为：

Ppm1d-6-1-F：GCCTAATATCACATGCATAGATTTG

Ppm1d-6-1-R：GGCTGAGCACCACTACTTCG

本发明还提供了一种检测Ppm1d基因多态突变位点的试剂盒，包括：

(i)组织DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR扩增反应液；

(iii)测序体系试剂；