[发明专利]一种基于切刻酶的双链核酸等温扩增检测新方法

权利要求书

1.一种在等温条件下扩增检测双链核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)切刻内切酶与DNA聚合酶联合作用于双链核酸靶标，循环扩增出单链或者5’端游离的悬垂片段，称为单链靶标；

(2)扩增引物P1、置换引物B1先后与步骤(1)中产生的单链靶标退火；并在DNA聚合酶的作用下进行合成以及链置换合成，产生游离的由扩增引物P1延伸形成的产物，称为单链模板；

(3)扩增引物P2与步骤(2)中游离的单链模板退火，在DNA聚合酶或者DNA聚合酶与切刻内切酶的共同作用下，单链模板与扩增引物P2相互以对方为模板延伸至5’端，形成完整双链核酸分子，下述均称为双链模板；

(4)切刻内切酶与聚合酶联合作用于步骤(3)中的双链模板，循环扩增出可与扩增引物P1或P2互补的单链；

(5)步骤(4)中扩增出的单链与扩增引物P1或P2退火，并在DNA聚合酶或者DNA聚合酶与切刻内切酶的共同作用下延伸成为双链核酸分子；

(6)切刻内切酶和聚合酶联合作用于步骤(5)中产生的双链分子，循环扩增出可与扩增引物P2或P1互补的单链；该单链与与扩增引物P1或P2退火后又产生步骤(5)所述双链核酸分子；

(7)重复步骤(5)和步骤(6)，以指数形式扩增产生核酸分子；

所述扩增引物P1和P2上有切刻内切酶的识别序列和在反应条件下能与目标核酸互补的碱基区域；

所述扩增引物P2与单链模板的3’端互补，两者退火后聚合酶能以单链模板3’端为起点合成DNA；

根据反应温度确定扩增引物P1和P2的3’端退火区域碱基个数，所述退火区域的Tm值比反应温度高3～5℃；所述置换引物B1的Tm值比反应温度低2～3℃；

所述方法为非诊断目的的方法。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于：应用两条扩增引物和一条置换引物实现靶标核酸的指数扩增。

3.如权利要求1或2所述方法，其特征在于：所述扩增引物P2为分子信标。

4.如权利要求1或2所述方法，其特征在于：所述DNA聚合酶具有链置换活性并且缺失5’→3’外切活性。

5.如权利要求1或2所述方法，其特征在于：步骤(1)中所述单链靶标的长度为20到1000碱基。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述单链靶标的长度为30到400碱基。

7.如权利要求1所述方法，其特征在于：扩增及检测的全部过程在等温条件下进行，而不必经历变温的程序。

8.一种用于权利要求1-3任一所述的在等温条件下扩增检测双链核酸的方法的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物组合，所述引物组合由权利要求1-3任一所述方法中的所述扩增引物P1、所述扩增引物P2和所述置换引物B1组成。