[发明专利]一种快速检测农作物中咪唑乙烟酸含量的试剂盒

权利要求书

1.检测咪唑乙烟酸的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括咪唑乙烟酸酶标板、咪唑乙烟酸标准品、咪唑乙烟酸抗体工作液、咪唑乙烟酸酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩样品稀释液和浓缩洗涤液。

2.检测咪唑乙烟酸的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括以下步骤：咪唑乙烟酸酶标板的制备、咪唑乙烟酸标准品的制作、咪唑乙烟酸单克隆抗体及其工作液的制备、咪唑乙烟酸酶标二抗工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩样品稀释液的制备。

3.根据权利要求2所述的检测咪唑乙烟酸的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的咪唑乙烟酸包被抗原是将咪唑乙烟酸半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)；用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将咪唑乙烟酸抗原稀释成1：20000比例，100μL/孔，37℃放置2h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150μL/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

4.根据权利要求2所述的检测咪唑乙烟酸的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的咪唑乙烟酸标准品浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、1.5ng/mL、4.5ng/mL、13.5ng/mL、40.5ng/mL。

5.根据权利要求2所述的检测咪唑乙烟酸的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的咪唑乙烟酸抗体工作液是采用咪唑乙烟酸人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：50000比例制备。

6.根据权利要求2所述的检测咪唑乙烟酸的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的咪唑乙烟酸酶标二抗工作液用酶标二抗稀释液稀释成1：5000比例；所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

7.权利要求2所述的检测咪唑乙烟酸的ELISA试剂盒的制备及检测方法，基于抗原抗体进行间接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤：

(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中；

(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(3)取包被有咪唑乙烟酸抗原的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；

(4)加入咪唑乙烟酸酶标二抗工作液，50μL/孔，然后加入咪唑乙烟酸抗体工作液，50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min；

(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；

(6)加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min；

(7)加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据）；

(8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中咪唑乙烟酸的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品：

(1)配制乙腈-水溶液（体积比为1:1）；

(2)研磨代表性样品（使50%的样品可以通过一个20目的滤网）；

(3)称量20g研磨过滤后的样品加入40mL乙腈-水溶液，样品稀释比为1：2(w/v)；

(4)在密封的容器里混合，震荡涡旋1min；

(5)室温离心4000r/min以上，10min；取1ml上清液到离心管中，50~60℃水浴氮气吹干；

(6)加入1mL稀释后的样品稀释液充分振荡混合30s，混匀待测。