[发明专利]一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途

说明书

本发明提供了一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途。本发明的融合蛋白所述融合蛋白从N端到C端依次含有B区缺失的凝血八因子、连接肽和人IgGFc变体。在本发明中，在B区缺失的凝血八因子和人IgGFc变体之间添加特殊设计的连接肽，可以使Fc区域远离B区缺失的凝血八因子分子的酶活性中心，从而提高融合蛋白的体外生物活性，且人的IgG Fc变体在CH2区域的228、235、445位点含有氨基酸突变，从而降低抗体Fc片段的ADCC效应功能。与现有的同类产品比较，具有类似或更高的体外生物活性、更低的vWF蛋白的结合力、更长的半衰期、更长的给药间隔以及更低的用药剂量。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

甲型血友病是一种先天性由凝血第八因子缺乏引起的出血性疾病，亦即是由于X-染色体关联的基因缺陷引起的体内凝血八因子的功能缺失，病人表现为创伤之后凝血功能障碍和反复自发性出血，逐渐导致软组织和关节腔受损而残废，其发病率为每十万分人口15～20。

甲型血友病最有效的治疗方法是输入正常人血浆、血浆来源的浓缩人凝血第八因子制剂或基因重组来源的凝血第八因子制剂，以达到治疗出血或者预防出血的目的。静脉输入基因重组凝血八因子制剂对甲型血友病患者进行预防性治疗的方案需要每周给药3次，每次给药剂量为每公斤体重25国际单位(25IU/kg)，以维持患者体内凝血八因子水平在正常人水平的1％以上。

欧美的发达国家都已经实现了用基因重组八因子对甲型血友病患者进行预防性用药，使这些患者可以免受病痛的困扰，和正常人一样地生活和工作。美国百特(Baxter)和拜耳(Bayer)两大公司最先推出全长的基因重组八因子。随后美国辉瑞(Pfizer)公司随后推出B区缺失的八因子，这种产品的蛋白序列去除了八因子序列中无生物学功能的B区，从而使八因子的分子量降低了38％，这种修饰不影响八因子的凝血功能，但在哺乳动物细胞表达水平上有显著提高。无论全长还是B区缺失的八因子都需要每周3次给药才能达到预防性用药的目的。

2014年美国百健艾代公司推出了第一个长效八因子Eloctate，Eloctate是B区缺失的八因子与抗体Fc片段连接形成的融合蛋白rFVIII-Fc。融合蛋白的半衰期在凝血八因子基因敲除的小鼠模型中为13.7小时，较原型八因子制剂的半衰期提高近一倍。在人体中的半衰期较原型八因子提高了80％，给药周期也从2天一次延长至3-5天给药一次，每次给药剂量为每公斤体重50国际单位(50IU/kg)。第一次实现了甲型血友病预防性治疗的实质性进步。由于修饰后八因子Fc融合蛋白半衰期没有大幅提升，这种治疗方案把甲型血友病患者接受治疗的间隔延长了一倍左右，但是病人的总给药剂量没有改变，患者用药的负担也没有降低。

因此，设计功能更强的FVIII-Fc分子，从而在用于预防性治疗甲型血友病中可以降低给药剂量或者延长给药间隔时间，是本发明要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途。本发明的融合蛋白与现有的同类产品比较，具有类似或更高的体外生物活性、更低的vWF蛋白的结合力、更长的半衰期、更长的给药间隔以及更低的用药剂量。

本发明的第一方面提供了一种凝血八因子融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次含有B区缺失的凝血八因子、连接肽和人IgGFc变体。

优选地，所述融合蛋白中，所述连接肽存在于B区缺失的凝血八因子和人IgGFc变体之间。

更优选地，所述融合蛋白中，含有两个IgG Fc变体，其中一个IgGFc变体的N端与所述B区缺失的凝血八因子的C端通过所述连接肽连接，形成含有B区缺失的凝血八因子的IgGFc变体，所述含有B区缺失的凝血八因子的IgG Fc变体的C端与另外一个IgG Fc变体的N端以二硫键连接。