[发明专利]检测邻苯二甲酸二丁酯的试剂盒制备及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体地涉及一种用于定量检测牛奶中的邻苯二甲酸二丁酯残留量的ELISA试剂盒及检测方法。

背景技术

邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是一种无色、有芳香气味的油状液体，蒸气压较低，易溶于乙醇、乙醚、丙酮和苯等有机溶剂。邻苯二甲酸二丁酯主要用作硝化纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯等的增塑剂，可使制品具有良好的柔软性，但因其和聚氯乙烯等塑料产品之间并非直接结合，而是由于范德华力和氢键等结合在一起，因此，易挥发进入环境造成污染，当前已在大部分生物介质和生物体中发现了DBP的存在。有研究显示，人体血液中已普遍发现了DBP的存在。各项研究表明，DBP给人类带来越来越多的危害，造成的严重影响已经逐渐引起人们的重视。目前有关DBP的毒性研究引起人们最大关注的是DBP的生殖毒性和发育毒性。研究表明，DBP可致雄性啮齿类动物睾丸标志酶活性下降、重量减轻、曲细精管变性萎缩、生殖道畸形等人体接触DBP的含量主要有空气、食物、饮水以及化妆品，长期接触DBP可使人患多发性神经炎，脊髓神经炎及脑多发神经炎等症状，误食过量DBP，可出现恶心、呕吐、头昏头痛及眼部刺激等可逆性症状。随着工业现代化的发展，DBP被广泛应用在塑料、油漆、涂料、香料等产品中，相关数据显示，仅国内DBP一年使用量就达170万吨。然而，作为一种环境内分泌干扰物，随着时间不断推移，DBP逐渐从各种物质中释放出来，迁移至水体、土壤、人体中，对人类造成极大的威胁和伤害。有研究发现，DBP具有一定的致癌、致畸、免疫抑制作用和神经毒性，尤其对人类生殖健康影响较大，DBP可影响雄性动物精液量、精于数量、精子活性，对后代生殖发育具有较大危害。近年来，DBP安全问题已经越来越多的引起卫生安全部门的重视。

当前有关DBP含量的检测方法较多，主要有GC、HPLC、LC．MS、GC．MS等方法，国内主要集中在GC和HPLC方法，虽然检测DBP含量的技术近些年已逐渐成熟，但此类方法大多成本较高，且操作相对繁琐，如何建立一种快速、准确、灵敏、成本低廉的检测方法已经成为当前DBP检测的首要问题。本研究旨在通过制备DBP单克隆抗体检测食品中DBP含量，建立一种快速、高效、准确、灵敏且经济的检测DBP含量的方法，可有效满足当前DBP含量检测的需要，将具有非常广阔的前景。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了检测邻苯二甲酸二丁酯的ELISA试剂盒，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，遁川于人批样·W-的俭测。本发明提供了检测邻苯二甲酸二丁酯的ELISA试剂盒的制备及检测方法。

检测邻苯二甲酸二丁酯的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括酶标板、邻苯二甲酸二丁酯的ELISA标准品、邻苯二甲酸二丁酯的ELISA抗体工作液、邻苯二甲酸二丁酯酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液利浓缩洗涤液。

检测邻苯二甲酸二丁酯的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括以下步骤：酶标板的制备、邻苯二甲酸二丁酯标准品的制作、邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体及其工作液的制备、邻苯二甲酸二丁酯酶标二抗工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。

其进一步特征在于：所述的邻苯二甲酸二丁酯包被抗原是将邻苯二甲酸二丁酯半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为鸡卵清白白蛋白(OVA)，用0.2mol/LNa₂C038mL，与0.2mol/LNaHC0317mL混合，再加75mL双蒸水，调pH值到9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将0.2mol/LNa₂C038mL，与0.2mol/LNaHC0317mL混合，再加75mL双蒸水，调pH值到9．6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，抗原稀释成1：4000比例，100uL/孔，37℃放置2h，取出酶标板拍掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300uL/孔，洗板2次，30s/次；然后加入10％牛血清白蛋白(BSA)封闭，180uL/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

所述的邻苯二甲酸二丁酯标准品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/ml、2.5ng/mL。

邻苯二甲酸二丁酯蛋白质偶联物单克降抗体工作液的制备：采用邻苯二甲酸二丁酯人工抗原免疫鼠所得到，该抗体工作液用抗体稀释液稀释成l：16000。