[发明专利]丙型肝炎病毒HCV实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种丙型肝炎病毒HCV实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，具体包括：捕获探针、HCV引物T7引物和nT7引物、HCV检测探针、M‑MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等试剂。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、快速地对含有丙型肝炎病毒的血清或血浆样品进行核酸扩增检测，具有检测效率高，准确度高的特点，能够检测出HCV的6个基因型，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及病毒的生物医学检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的丙型肝炎病毒HCV的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus, HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要经输血，针刺，吸毒等传播，据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3%，估计约1.8亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)。一些数据显示，未来20年内与HCV感染相关的死亡率（肝衰竭及肝细胞癌导致死亡）将继续增加，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。因而，对丙型肝炎病毒的检测对临床辅助诊断具有重要作用。

抗HCV酶联免疫试剂是目前诊断丙肝的主要手段，普遍应用于检查血源和血液制品，此类试剂已被广泛应用，但由于HCV病毒的分离尚不成功，目前所制备的抗原均为人工合成，其特异性方面仍然存在不足，主要是在低危人群中发现大量的不确定结果；对于某些免疫球蛋白水平高的患者，也可能出现假阳性。另外，感染后至抗体出现，在第二代试剂间隔为9-10周，第三代为6-8周，因此对于HCV感染的早期检测还需加强。试纸条免疫印迹试验现已有第二代试剂，灵敏度和特异性有所提高，主要用于ELISA检测可疑者，能帮助区别特异性HCV抗体和非特异性反应。HCV抗体检测方法虽然有了改进，但仍然存在其局限性：“窗口期”平均长达70天，不利于早期诊断；而且只代表既往感染，可在病毒清除后仍长时间存在，有报道说该时间可长达9年，无法准确判别抗-HCV阳性者是否有病毒血症。

HCV RNA是病毒复制和肝炎进程的确切标志。通过荧光PCR的方法直接检测HCVRNA，大大提高HCV感染的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，可将“窗口期”缩短平均56-60天，对“窗口期”感染的筛选和提高输血安全也非常有意义。此外，在抗病毒药物治疗中，HCV RNA是对其疗效评价的指标之一；检测HCV RNA的滴度和基因型可对用药和预后提供参考。治疗过程中，HCV RNA的动态监测同时还可以为临床上的用药剂量、时间等提供依据。

核酸检测主要涉及核酸提取与和核酸扩增检测。

目前血清和血浆中病毒核酸的提取方法主要有酚-氯仿法和柱提取法及磁珠法。酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法需离心，频繁更换离心管，用时长，特异性较差，无法有效去除复杂样本中的抑制物，体系中一般没有阳性内对照（即内标），无法预防假阴性。磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法，其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性有机溶剂，提取纯化的核酸质量好、产量高，提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化，这些优点及特点使其提取核酸的方法有替代所有其它方法的发展趋势。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环即可以快速扩增。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性结合实际样本基质进行专门、针对性地设计。目前尚无针对丙型肝炎病毒RNA进行检测的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。