[发明专利]自噬溶酶体过氧化氢标记物

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂领域，是一种用于检测自噬溶酶体过氧化氢的标记物。 

背景技术

本发明涉及一种由有机化合物配体与金属离子组成的络合物及其作为自噬溶酶体过氧化氢标记物。此发明制得的化合物可作为自噬溶酶体过氧化氢的标记物，用于检测自噬过程中过氧化氢含量，特别是关于溶酶体疾病，例如检测和监测溶酶体中过氧化氢累积过程、监测与溶酶体过氧化氢相关的疾病的生理过程；此发明也是关于毒性筛选方法，特别是对于潜在药物和可疑有毒物质的方法和高通量筛选；也可以用于基于荧光显微镜，共聚焦显微镜的实验和组织成像。 

细胞自噬是哺乳动物细胞溶酶体降解的主要途径，对维持细胞的自我平衡、发展和能量平衡非常重要。细胞自噬过程的中断与神经退化性紊乱、癌症、心脏病和感染等疾病密切相关。通过研究细胞自噬及其复杂的分子诱导机制，探索自噬在细胞发生、发展中发挥的作用，为疾病治疗提供了新的途径。通过调节细胞自噬活性的治疗已经成为当代肿瘤治疗和帕金森等疾病治疗领域的新靶点和研究热点。无论科研单位还是制药公司对药物诱导细胞自噬在疾病治疗中的应用表现出极大兴趣，期望通过研究自噬和死亡的关系和分子机理，进而利用细胞自噬的调节作用，使其在疾病治疗中发挥作用。 

基于细胞的检测由于它们的高生理的相关性，在制药工业中越来越受欢迎。其它优点包括他们预测化合物的用途的能力，评估分子相互作用，确定毒性，区分细胞类型与特异性药物效果，并确定药物渗透。基于细胞的实验是始终相关的药物发现渠道，因为它们能够提供从目标特性到毒理学终端阶段的数据。当前行业发展趋势要求，使用细胞实验进行药物筛选时容易进行监测，且能够非侵入性的报道数据。对新药开发而言，其根本途径是提高效率，降低成本，在更短的时间上市场。为早期阶段失败的化合物提供丰富的信息和准确的数据对早期阶段的决策是必需的。这些数据可能会来自筛选化合物的结果中，即筛选相关的生态系统，而不是经典生化分析。这些筛选系统通常整合在先进的成像平台，如高通量筛选（HCS）工作站。产业化荧光显微镜将导致高通量HCS影像平台的发展。当加上荧光报告技术，HCS提供了信息丰富的药物筛选，以及新类型的药物靶标。因此，开发一种快速有效的荧光探针对于监测细胞自噬过程和诊断相关疾病是非常必要的。 

过氧化氢（H2O2）是活性氧簇（ROS）的主要成员，作为有益或有害的信号标志在生理和病理过程中扮演重要的角色。H2O2的有益/有害之分取决于其生产和累积的浓度及亚细胞位置。越来越多的证据表明，不仅是ROS产生的主要环境，如线粒体，内质网和细胞膜，还包括溶酶体参与的对过氧化氢循环的调节，最终决定了ROS的生物结果和细胞区域间的通讯。溶酶体中过量H2O2之间的交叉干扰将会导致溶酶体功能障碍，甚至破裂，这与自噬和细胞凋亡密切相关。因此，在活细胞中使用具有高分辨率的溶酶体H2O2成像技术非常重要。 

虽然由化学或遗传操作的亚细胞如线粒体，内质网（ER），细胞膜和细胞核成像以取得巨大进展，但用于检测溶酶体H2O2的方法报道很少。对于这种探针的主要挑战包括：（1）溶酶体的酸性（pH为4.5-6）对基于亲核反应的荧光H2O2 探针和基因编码的荧光蛋白均不利; （2）由于过氧化氢是活性氧之中的中等的亲电剂，所以化学选择性低； （3）缺少能够靶向溶酶体的官能团。 

发明内容

本发明提供一种荧光探针，它具有良好的生物活性和选择性，可以在很宽的pH范围内作用。该探针是细胞渗透性的，并可以被用于可视化的外源或内源性的溶酶体内过氧化氢。 

本发明还提供一种基于此标记物的自噬溶酶体过氧化氢检测的方法，包括以下步骤：1）获得样品细胞；2）标记物进入到细胞的自噬溶酶体内；3）通过检测标记物监测溶酶体内过氧化氢量。此方法可以运用在如下领域：1）实时监测细胞自噬溶酶体内过氧化氢的量；2）检测与自噬溶酶体过氧化氢相关的药物的作用效果；3）药物筛选。 

本发明适合的应用涉及：荧光扫描显微镜、流式细胞仪、共聚焦显微镜、荧光分析仪、基于微孔板的细胞技术、细胞微阵列分析、组织成像等。