[发明专利]一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种人热休克蛋白gp96的抗体及其制备方法与应用；特别涉及一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用。

背景技术

热休克蛋白(gp96蛋白)存在于人和动物几乎所有细胞的内质网膜中，也存在于某些细胞的质膜上，它是热休克蛋白90家族(HSP90)中的成员。

人的全长gp96蛋白由803个氨基酸组成，自N末端第1至21个氨基酸残基组成信号肽，因此成熟的gp96蛋白由782个氨基酸组成。gp96蛋白是糖蛋白，该分子拥有6个潜在的糖基化位点。

犬类的gp96(与人的gp96高度同源，有98.5％的同源性)与ATP结合的晶体结构已经解析，单个分子分为N端结构域、中间(M)结构域和C端结构域，gp96蛋白以同源二聚体的形式存在，其N端结合ATP，C端形成二聚化，整个二聚体从C端到N端围绕分子中轴左旋扭曲形成扭曲的V字形。

gp96蛋白与ATP的结合及发挥水解ATP的功能与其构象变化相关，其构象变化涉及N端结构域和M段结构域的90°的旋转，gp96蛋白构象变化引发与其它蛋白的结合或释放。

新型小分子抗体单链可变区片段(scFv)是由一弹性接头(linker)将V_H和V_L连接而成的两个可变区首尾相接的单一肽链,通过正确折叠，两个可变区由非共价键形成具有抗原结合功能的Fv段，此单一肽链的结构既有利于表达和进行基因重组操作，也增加了Fv的稳定性。scFv抗体具有抗原结合部位的最小功能结构单位，由于其分子量小、体内半衰期短、免疫原性低、易于基因工程操作等特点而倍受关注。

Comp是来源于软骨寡聚基质蛋白的α螺旋肽段，该肽段自然存在于人类多种蛋白质中，主要参与蛋白的寡聚化。

发明内容

本发明的目的是提供一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用。

本发明提供一种制备人热休克蛋白gp96的scFv抗体的方法，是将gp96抗体的重链可变区和compα螺旋在原核细胞中进行融合表达得到融合蛋白；

所述gp96抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第3位至第116位所示；

所述compα螺旋的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第123位至第170位所示；

所述融合蛋白为由含有gp96抗体的重链可变区和compα螺旋的抗体单体在所述原核细胞中自动组装形成的多聚体。

上述方法中，所述gp96抗体的重链可变区和所述compα螺旋分别在所述含有gp96抗体的重链可变区和compα螺旋的抗体单体中的N端和C端。

上述任一所述的方法中，所述融合表达的方法是将5’-3’方向依次含有gp96抗体的重链可变区编码基因和compα螺旋编码基因的DNA片段导入所述原核细胞中。

上述任一所述的方法中，所述gp96抗体的重链可变区编码基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第7位至第348位核苷酸所示；

所述compα螺旋编码基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第367位至第510位核苷酸所示。

上述任一所述的方法中，所述5’-3’方向依次含有gp96抗体的重链可变区编码基因和compα螺旋编码基因的DNA片段如SEQ ID No.1所示；

所述含有gp96抗体的重链可变区和compα螺旋的抗体单体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述DNA片段是通过重组表达载体导入所述原核细胞中的，所述重组表达载体具体是将SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pET28a(+)质粒EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点间得到的；

所述原核细胞为大肠杆菌；

所述大肠杆菌具体为BL21(DE3)。

上述任一所述的方法中，所述表达之后还包括细胞裂解、离心收集沉淀并将沉淀进行层析分离的步骤；

所述细胞裂解的方法具体为超声破碎。

上述任一所述的方法中，所述层析分离包括镍离子亲和层析和分子筛层析；

所述镍离子亲和层析的步骤如下：

a、用8M的尿素溶液预平衡镍离子柱；

b、将所述离心收集的沉淀溶解后得到的上清加入镍离子柱；

c、用8M的尿素溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去非特异性结合的蛋白；

d、用60mM咪唑溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去杂蛋白；