[发明专利]基于三重信标修饰的金纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射效应检测水溶液中Hg2+和/或Ag+的方法

权利要求书

1.基于三重信标修饰的金纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射效应来同时检测水溶液中二价汞离子和/或银离子的方法，其特征在于步骤为：

（一）检测方法的建立：

（1）二水合双（对-磺酰苯基）苯基膦化二钾盐BPS包裹的20nm金纳米粒子的制备：取150mL锥形瓶和配套的转子，用新鲜配制的王水浸泡24h并用超纯水冲洗三次，烘干备用；取97.5mL的超纯水放入洗涤洁净的锥形瓶中，在瓶口盖上保鲜膜防止外界灰尘进入；然后将装好超纯水的瓶子放在可加热的磁力搅拌仪上，将温度调至450℃、调转速800r/min，边加热边搅拌；2 min后加入2.5mL 4g/L的氯金酸溶液，继续加热至沸腾；迅速加入1.8 mL 10mg/mL的柠檬酸三钠，观察溶液颜色变化，待溶液变为酒红色后将温度调至250℃继续煮沸20min；将加热完毕的溶液降至室温后浓缩十倍用超纯水重悬，加入二水合双（对-磺酰苯基）苯基膦化二钾盐溶液至终浓度为10mg/mL，振荡过夜，8000 r/min离心10min，用0.5×TBE重悬，放置在4℃备用，BPS包裹后的Au纳米粒子记为AuNP；

（2）检测用的核酸探针的设计与合成：

巯基修饰的单链核酸探针：

DNA 1：5’-SH-TCAGACGTTT TTT-3’，

DNA 2：5’-SH-TCAGGATCCC CCC-3’，

DNA 3：5’-SH-TCAGAGCTTG CGTCATGAGA CGCTCCCCCC ATC -3’，

未做任何修饰的单链核酸探针：

DNA 4：5’-GTAGCGAGAT GACGCAAGCT-3’，

DNA 5：5’-AGCGTGAGGC TACTTTTTTC GT-3’，

首先制备金纳米粒子和核酸的偶联物：把AuNP分别和DNA1，DNA2，DNA3按摩尔终浓度为1︰1的比例混合在一起，反应1h后加入NaCl溶液至终浓度为50mM，混合均匀反应过夜；形成AuNP-DNA1，AuNP-DNA2，AuNP-DNA3；接下来DNA4与DNA5和 AuNP-DNA3按摩尔终浓度为2︰2︰1的比例混合，加入NaCl至终浓度为50mM，放置在95℃水浴锅中5 min，然后37℃放置8h，离心除去未杂交的DNA，即得到连有金纳米粒子的“Y”形DNA骨架AuNP-DNAY；

（3）信标分子的修饰：分别把AuNP-DNA1，AuNP-DNA2，AuNP-DNAY分别与终浓度为5μM的4-氨基苯硫酚ATP，4-硝基苯硫酚MATT，4-甲氧基苄硫醇NTP信标混合，室温反应8h，然后将修饰了ATP的AuNP-DNA1和/或修饰了MATT的AuNP-DNA2与修饰了NTP的AuNP-DNAY按体积1︰1︰1或1︰1的比例混合，即制备得到检测用的拉曼探针溶液；

（二）重金属离子Hg²⁺和/或Ag⁺的检测：

（4）Ag⁺的检测：25nM经过信标分子修饰的AuNP-DNAY和AuNP-DNA2按体积1︰1混合，缓冲体系为0.5×TBE，终浓度为50mM的NaNO₃ 溶液；含0-0.5ng/mL不同浓度的Ag⁺水溶液加入到上述检测体系中，并在室温下反应1h，使Ag⁺诱导的DNA杂交反应进行完全，然后测定样品体系的拉曼信号；

（5）Hg²⁺的检测：检测方法和步骤（4）类似，将AuNP-DNA2换成AuNP-DNA1，Ag⁺ 溶液换成Hg²⁺溶液，即经过信标分子修饰的25nM的AuNP-DNAY和AuNP-DNA1按体积1︰1混合，缓冲体系为0.5×TBE，终浓度为50mM的NaNO₃ 溶液；含0-0.5ng/mL不同浓度的Hg²⁺水溶液加入到上述检测体系中，并在室温下反应1h，使Hg²⁺诱导的DNA杂交反应进行完全，然后测定样品体系的拉曼信号；

（6）Ag⁺和Hg²⁺同时检测：检测方法和步骤（4）类似，只是检测体系多添加AuNP-DNA1，并将Ag⁺溶液换成Ag⁺和Hg²⁺的混合溶液，即经过信标分子修饰的25nM的AuNP-DNAY与AuNP-DNA1和AuNP-DNA2按体积1︰1︰1混合，缓冲体系为0.5×TBE，终浓度为50mM的NaNO₃ 溶液；含0-0.5ng/mL不同浓度的Ag⁺和0-0.5ng/mL Hg²⁺水溶液加入到上述检测体系中，并在室温下反应1h，使Ag⁺和Hg²⁺诱导的DNA杂交反应进行完全，然后测定样品体系的拉曼信号。