[发明专利]重组蛹虫草超氧化物歧化酶的制备方法

说明书

本发明提供一种适合大肠杆菌分泌表达重组蛹虫草超氧化物歧化酶(recombinant cordyceps militaris superoxide dismutase，rcSOD)的信号肽核苷酸序列和编码蛹虫草SOD的SOD核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的载体、含有前述载体的工程细胞以及从该工程细胞纯化rcSOD的方法。优化后的超氧化物歧化酶基因非常适合大肠杆菌表达，具有高表达、高稳定、高分泌的特点。本发明可高效、简便、低成本地获得rcSOD纯品。本发明还包括通过上述方法制备的重组蛹虫草超氧化物歧化酶在制备治疗与人超氧化物歧化酶相关疾病或病理症状的药物、食品、保健品及其化妆品中的应用。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌分泌表达重组蛹虫草超氧化物歧化酶的编码信号肽的核苷酸序列和编码蛹虫草SOD的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的载体、含有前述载体的工程细胞和从该工程细胞纯化rcSOD的方法及其用途，属于基因工程和蛋白质生物化学领域。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞。按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜(Cu)锌(Zn)金属辅基的称(Cu.Zn-SOD)，最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是是含锰(Mn)金属辅基的称(Mn-SOD)，呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种是含铁(Fe)金属辅基的称(Fe-SOD)，呈黄褐色，存在于原核细胞中。

超氧化物歧化酶能够清除超氧化物，保护细胞免受氧化损伤。超氧化物与非自由基的反应是自旋禁阻的。在生物学系统中，这就意味着它主要是与自身(歧化)或另一个生物学自由基(如一氧化氮)反应。超氧化物阴离子自由基(O2-)能够较快地(在pH＝7时，反应速度为105M-1s-1)歧化为O2和过氧化氢(H2O2)。但超氧化物能够与特定的分子(如NO自由基)以更快的速度反应，生成过氧亚硝酸根离子(O＝N-O-O-)，因此超氧化物歧化酶的催化作用就显得尤为重要。而且，超氧化物的歧化反应与其初始浓度的平方相关，因此虽然高浓度的超氧化物半衰期很短(比如0.1mM浓度下为0.05秒)，但低浓度的超氧化物的半衰期相当长(0.1nM浓度下可达14小时)。相比较而言，超氧化物歧化酶催化的歧化反应对于超氧化物初始浓度只是一级反应，并且在所有已知酶中具有最快的转换数(与底物反应速率)(7x 109M-1s-1)(Loeffler Petrides Heinrich.Biochemie&Pathobiochemie.8thEdition.2007.123.)，因此反应速率的限制只是在于酶和超氧化物分子间的碰撞频率，即反应速率是“扩散限制性”的。