[发明专利]香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种香梨优斑螟污染的分子检测方法，具体地说，涉及一种香梨优斑螟荧光PCR检测方法，其属于生物技术领域。

背景技术

香梨优斑螟(Euzophera pyriella Yang)属鳞翅目螟蛾科斑螟亚科优斑螟属的杂食性害虫，是1994年经杨集昆教授定名的害虫新种，为新疆特有的果树蛀干害虫。自20世纪80年代后期首次发现以来，扩散蔓延，危害严重，其中库尔勒香梨被害株率最高，受害株率常高达100％，是香梨的主要害虫之一。主要危害梨、苹果、无花果、枣、杏、巴旦杏、桃等果木，严重影响果品产量和品质。

以幼虫危害果树和林木的枝、干，在寄主的韧皮部与木质部之间蛀食为害，形成不规则的隧道，影响寄主的生长，严重时造成死枝。蛀孔外常堆集褐色颗粒状粪便，较易识别。幼虫还危害果实，蛀食果肉，果心和种子，在新疆梨园、苹果园中与其他食心虫混合危害，使虫果率上升。该虫危害可以引起梨树腐烂病发生，造成树势衰弱，甚至死亡。

香梨优斑螟形态特征，成虫：体长6～10mm，翅展14～20mm。体大部分呈灰褐色至暗褐色被鳞光滑。复眼大而圆赤褐色。前翅狭长灰褐色，两条灰白色横线之间颜色较暗。后翅灰褐，外缘较深，缘毛灰白。卵：椭圆形，长约0.55～0.60mm，宽0.30～0.55mm，表面密布网纹，初产时乳白色，孵化前暗红色。幼虫：老熟幼虫体长8～17mm，体色深灰色(灰黑色)，头部棕褐色，腹足趾钩2序，全环式。蛹：长约7mm，腹面黄褐色，背面褐色，臀刺12或13个。

香梨优斑螟的发生特点：一年发生3代，以老熟幼虫在树干的翘皮、裂缝、树洞中结灰白色长形薄茧越冬，也有的在为害蛀食处或苹果、梨的果实内越冬。翌年3月下旬开始化蛹，4月上、中旬为化蛹盛期，4月下旬为羽化盛期。第1、2代成虫羽化高峰分别在6月上中旬和7月中下旬，第3代幼虫7越下旬和8月上旬发生。10月份幼虫逐渐进入越冬状态。幼虫蜕皮4次，共5龄，幼虫历期25～40天，主要为害香梨树枝杆和香梨果实。十几年前只在新疆局部个别香梨园为害，现已遍布天山南北，成为香梨等果树的重要害虫之一。

苹果蠹蛾(Cydia pomonella L.)，梨小食心虫(Grapholitha molesta(Busck))和香梨优斑螟为我国常见的蛀果性害虫，此三种害虫的低龄幼虫在外部形态上非常相似，没有显著差异，目前，我国检疫部门对梨小食心虫的分类鉴定主要是以老熟幼虫或成虫的外部形态特征为依据，在果品出口、运输和实施检疫控制前准确地区分检疫性害虫是相当必要的，目前大多凭借形态学特征只能区分成虫、晚龄期害虫，大多数的检疫性有害生物较短暂的幼虫阶段很难依靠形态学特征精确区分，但苹果蠹蛾、梨小食心虫和香梨优斑螟等有害生物的幼虫基本是在水果采收时大量出现，同时中、外双方截获的害虫形态特点都不明显，有时以残体形式出现，给种类的鉴定带来很大困难。国外在截获有害生物时，截获检疫性有害生物和截获一般有害生物，对货物处理，产地的制裁，出口的限制有很大的区别。从收到的国外通报看，对方国对截获有害生物的鉴定结果五花八门，我方想对对方结果进行质疑，缺乏有力的证据和方法。检验方法的不成熟和低分辨率依然会造成进口国在截获检疫性有害生物时采取严厉制裁措施的风险。带来过多的技术纠纷，增加禁止出口的风险，增加检疫性处理或者退货会产生较大的费用消耗。因此，建立一种香梨优斑螟快速、灵敏、准确的分子生物学检测方法是十分必要和紧迫的，对口岸检疫和防治监测都有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法。本发明具体给出了用于香梨优斑螟实时荧光PCR检测的引物和Taqman探针，本发明能用于有效地从蛀果性害虫(包括梨小食心虫、苹果蠹蛾和香梨优斑螟等)中区分出香梨优斑螟。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种香梨优斑螟实时荧光PCR检测方法，检测中所用的特异性引物和探针的核苷酸分别为：

特异性引物为：

F-Primer:5’-CTGCCTTATTACTACTTCTTTCACTACCT-3’

R-Primer:5’-AATAGGGTCTCCCCCTCCT-3’

探针为：

Probe：5’-(FAM)CGGAATCTTAATACTTCTTTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3’。

即，本发明给出了一种香梨优斑螟的鉴定引物，其核酸序列如SEQ ID No.1和2所示，其中，SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为正向引物，SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为反向引物。