[发明专利]布鲁氏杆菌 LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于动物卫生和食品检验技术领域，涉及一种用于检测布鲁氏杆菌菌株的LAMP-LFD试剂盒及其检测方法。

背景技术

布鲁氏菌病（简称布病，Brucellosis，又称地中海弛张热、马耳他热、波浪热或波状热）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种变态反应性人畜共患传染病，严重地威胁着多种动物和人的健康，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生危害。我国农业部将其列为二类动物疫病，卫生部将其列为乙类传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病。其在自然环境中生活力较强，在病畜的分泌物，排泻物及死畜的脏器中能生存4个月左右，在食品中约生存2个月。羊、牛、猪是其主要宿主，羊、牛、猪和其畜产品与人类接触密切，从而增加了人类感染的机会，因此建立快速、准确的检测方法是保证人类和动物生命安全的重要手段。

传统的布鲁氏杆菌诊断主要通过病原分离与生化鉴定完成，但其存在细菌培养操作繁琐、耗时长，不易鉴别相近物种或亚型等缺点。随着分子生物学检测技术的发展，以omp25基因、omp31基因、BM28基因等为靶标建立的PCR或实时定量荧光PCR技术已成功应用于布鲁氏杆菌的实验室诊断，具有特异性强、灵敏度高和速度快等优点，但该方法必须配备昂贵的仪器设备，需专门的操作人员，在适应性上有一定的缺陷。环介导等温扩增技术是Notomi等于2000年建立的，该技术通过针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等温65℃左右，几十分钟，即可实现核酸的高效扩增。该方法仅需要简单的水浴锅或加热器，操作简便、特异性强、灵敏度高、检测快速，适合于基层及现场使用。

2008年Kiatpathomchai首次将横向流动试纸条技术与环介导等温扩增技术相结合(LAMP-LFD)，用于LAMP扩增产物的检测(Kiatpathomchai et al., 2008)。目前，该方法已被成功用于嗜盐弧菌、人的非洲锥虫病、副溶血霍乱弧菌、桃拉病毒、传染性肌肉坏死病毒、对虾白斑症病毒等病原的检测。在横向流动试纸条技术检测反应中FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，并与胶体金标记的抗FITC的抗体结合形成三元复合物，并结合在横向流动试纸条具有生物素抗体的检测线上；未杂交的FITC标记探针与胶体金标记的抗FITC的抗体形成不含生物素的两元复合物，通过检测线，结合在控制线上。这样可以通过检测带是否显色判断扩增产物的有无。该检测方法依赖于序列之间的特异性扩增，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。并且不需要电泳装置和凝胶成像系统，无需EB等有毒试剂，检测时间短，结果可肉眼观察。因此，LAMP-LFD方法安全、快速、高效且无设备及技术限制，具有其他技术无法替代的优势。

本专利将环介导等温扩增技术（LAMP)）与横向流动试纸条技术（LFD）相结合，针对布鲁氏杆菌重要的毒力因子omp25基因设计一套引物和探针，优化反应条件，建立布鲁氏杆菌LAMP-LFD检测技术。本试剂盒操作简便，作为布鲁氏杆菌的初筛工具,尤其适用于基层检验检疫机构,为布鲁氏杆菌的疫情监控和快速检测提供了新的发展方向。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种用于检测布鲁氏杆菌的LAMP特异性引物组和1个特异性探针，它包括：

BRU-F3 GACGGCCTGGAAGTCAAG       SEQ ID NO：1 

BRU-B3     GGGTGTAACGGTACTCAACG       SEQ ID NO：2 

BRU-FIP  GAGGTACGGCATAACCGGGTTCTTTTCGGAATTCCGGCTTTGAAGGCTCGCTCG SEQ ID NO：3 

BRU-BIP  AACAACGGCTTGGACGACGATTTTTGTCCGTCAGCTTGGCTT   

 SEQ ID NO：4

BRU-HP ACCCAGTACGGCAACAAGAAC      SEQ ID NO：5

其中BRU-FIP引物和BRU-HP探针分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素。

本发明进一步公开了采用用于检测布鲁氏杆菌 LAMP-LFD特异性引物组制成的检测试剂盒，其特征在于它的组成如下：

（1）LAMP反应液：