[发明专利]猪链球菌2型LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测猪链球菌2型菌株的LAMP-LFD试剂盒及其检测方法，属于动物卫生和食品检验技术领域。

背景技术

猪链球菌病（Streptococcus suis ,SS）是由猪链球菌引起的人兽共患传染性疾病，根据菌体荚膜多糖的多样性，猪链球菌分为1~34型和1/2型，共35个血清型，其中猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype2,SS2）致病力最强，人感染后会出现发烧、脑炎、败血症等症状，严重者可发生中毒性休克导致多器官衰竭甚至死亡。1951年，Jansen和Van Dorssen在世界范围内首次报道猪链球菌病，之后英国、美国等许多国家先后报道了人感染猪链球菌病例。1998年我国首次报道人感染猪链球菌病例，国内四川省、湖南省、浙江省等地均发生了人感染猪链球菌病疫情。猪肉是人类重要的食品，其安全性越来越引起人们的关注。猪链球菌2型作为重要的动物源性人畜共患病原给人们的健康和生活造成了重大威胁。因此，建立准确而快速的猪链球菌2型检测方法是当前猪链球菌防控的关键，也是食品检疫急需的手段。

 荚膜多糖（cps）为公认的猪链球菌毒力因子，它能保护细菌在非免疫动物体内不被吞噬。猪链球菌２型cps共有cps2Z、2J等14个开放阅读框，其中cps2J基因除与1/2型有较高同源性外，与其他血清型的序列同源性都很低，是目前国内外利用分子生物学技术鉴别猪链球菌２型种型的靶基因。

 本发明针对猪链球菌cps2J基因设计了型特异性引物，建立了一种能检测猪链球菌２型血清型的LAMP-LFD检测体系，其中的2条促环引物分别标记了异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)和地高辛（Digixon，Dig）。当LAMP扩增后，阳性扩增产物具有异硫氰酸荧光素和地高辛的双重标记，而阴性产物不具有双重标记。将横向流检测试纸条插入检测缓冲液后，LAMP扩增产物与胶体金标记的抗异硫氰酸荧光素的抗体结合形成三元复合物，通过层析作用，结合到试纸条的生物素抗体标记的检测线上，呈现红褐色；LAMP阴性扩增样品不具有双重标记，不能与胶体金标记的抗异硫氰酸荧光素的抗体结合形成三元复合物，也不能与检测线结合，检测线不显色。

  本发明具有快速、特异、敏感等特点，不需特殊仪器设备和实验条件，操作更为简便安全，非常适用于临床和基层使用，对SS2突发公共卫生事件应急处置的早期筛查和食品卫生检验具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种用于检测猪链球菌2型的LAMP特异性引物组，其特征在于它是由下述引物组成：

CPS-F3 TGGTGTTTCAAACGCAAG      SEQ ID NO：1 

CPS-B3     TGCAGCTCAGATTCTTGA       SEQ ID NO：2 

CPS-FIP  GCCGTCAACAATATCATCAGAATCTTTTGAATTACGGTATCAAAAATAGCAC

SEQ ID NO：3 

CPS-BIP  ACATTGTTGAGTCCTTATACACCTGTTTTCCATCAAAAGTAGCAAGT 

SEQ ID NO：4

CPS-LF   TCGTTTAATATAATACAAACAT    SEQ ID NO：5

CPS-LB    GAGAATGATAGTGATTTGTC      SEQ ID NO：6。

其中CPS-LF和CPS-LB  引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。

本发明进一步公开了用于检测猪链球菌2型 LAMP-LFD的检测试剂盒，其组成如下：

（1）LAMP反应液：

 LAMP反应液中含有：2×Buffer（含Mg²⁺） 2.5μL；CPS-F3  0.5μL； CPS-B3  0.5μL；CPS-FIP 4μL；CPS-BIP 4μL；CPS-LF  0.5μL； CPS-LB  0.5μL；dNTPs 3.5μL

（2）超纯水

（3）Bst酶（8U/μL）  

（4）横向流动试纸条：购自Milenia Biotec GmbH公司

（5）用于检测猪链球菌2型的LAMP特异性引物；其中的引物指的是：

CPS-F3 TGGTGTTTCAAACGCAAG      SEQ ID NO：1