[发明专利]一种使牛trim5α基因沉默的siRNA及其应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体地说，本发明涉及一种牛trim5α下调表达的siRNA及其应用。

发明背景

在RNA干扰技术出现以前，基因敲除(gene knockout)是主要的反向遗传学(reverse genetics)研究手段，但其技术难度高，操作复杂，周期长。由于RNA干扰可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的同时又具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或减低突变序列特异方式剔除目的基因表达，现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。在功能基因组研究中，需要对特定基因功能丧失或减低突变，以确定其功能，因此RNA干扰可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。

大量研究表明，针对同一靶基因的不同siRNA序列具有不同的沉默效率，要从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，运用RNAi技术更有效地沉默靶基因，siRNA序列的设计是关键环节。siRNA序列在靶基因中的位置一般从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好(McManus MT等.RNA，2002，8(6)：842-850)。以前的研究表明：不要以5′非翻译区(5′UTR)和3′非翻译区(3′UTR)及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RNA诱导的沉默复合物(RISC)竞争结合siRNA序列，降低RNAi效应(Elbashir SM等.2002，26(2)：199-213)；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多态性(SNP)区域。但也有研究发现，在5’UTR中引入一个抑制翻译的茎-环结构，这样可以改变mRNA半衰期(Anthonisen IL等.RNA，2001，7(7):1024－1033)。当5’UTR的序列中存在着碱基配对时，就可形成发卡式或茎环状二级结构。这类结构会阻止核糖体小亚基的迁移，对翻译起始具有顺式阻抑作用。因此运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默(Doench JG等.Genes Dev，2003，17(4)：438-442；Eckmann CR等.Dev Cell,20023(5):697-710)，这些发现使siRNA序列的筛选范围涉及到了基因全序列的非编码区和编码区。

目前常用的三种RNAi的研究策略如下：第一种是直接合成针对靶基因的siRNA,通过转染的方法使之进入细胞内，参与到RNAi途径，发挥使靶基因沉默的效应。二是构建shRNA的质粒表达载体转染细胞，在细胞内转录生成shRNA，利用细胞内的Dicer酶生成相应的siRNA，发挥RNAi作用。三是构建shRNA的病毒表达载体，常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等，机制与质粒载体相似，利用了病毒感染细胞效率比较高的特点，解决了用质粒载体转染效率低的缺陷。利用病毒载体把shRNA导入细胞，载体中的U6启动子确保shRNA总是表达；这种装载了shRNA载体可被传递到子代细胞中去，从而使基因的沉默可被遗传。