[发明专利]抗鸭肝炎病毒转移因子的体外制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽药领域，更具体的说，是一种抗鸭肝炎病毒转移因子的体 外制备方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎简称鸭肝炎，是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种传播迅速和 高度致死性传染病，是一种肝脏呈现出血炎症状态的急性烈性传染病。该病 的主要特征为肝脏肿大呈斑点状出血，胆囊肿大，胆汁颜色变淡，有出血斑 点和神经症状。在初次感染疫区，该病的死亡率很高，可达90％以上。

鸭病毒性肝炎主要发生于4～20日龄雏鸭，中成鸭一般不发病，鸡和鹅 也不能自然发病。该病的主要传染源是病鸭和带毒鸭，主要通过消化道和呼 吸道感染，饲养管理不良，如缺乏维生素和矿物质，鸭舍潮湿、拥挤等，均 可促使本病发生。本病发生于雏鸭孵化季节，一旦爆发，传播很快，发病率 可达100％，给养殖业带来了很大的经济损失。

转移因子(Transferfactor,TF)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息 的可透析小分子物质-多肽核苷酸复合物，它能够特异地将供体的细胞免疫信 息转移给受体正常的淋巴细胞，从而增强受体的免疫功能。可以抵抗真菌、 病毒等非细菌性感染，也可以是否白介素与干扰素作用于免疫应答过程。TF 含多种成分，分子量小，无热原，无抗原性，无毒副作用，是一种新型而又 安全的免疫制剂。此外，转移因子无种属特异性，动物来源的转移因子可用 于人体。

目前转移因子的生产工艺主要是通过研磨动物脏器等，反复冻融并经半 透膜透析得到，工艺复杂，无特异性，回收率低。本发明通过体外制备抗鸭 肝炎病毒特异性转移因子特异性强、产出率高，对转移因子的大规模工厂化 生产以及大范围应用具有很好的促进作用。

发明内容

本发明的目的是克服现有转移因子技术中制备以及针对疾病没有特异 性，治疗效果不稳定等缺点，提供一种体外免疫方法生产特异性强、成本低、 产出率高、效果更好的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的制备方法。

本发明抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，按照以下步骤进 行:

(1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单 层。无菌静脉采取动物全血20-30ml，加0.8％肝素溶液0.3m1抗凝，静置 30-60min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层 上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复 洗涤2-3次，离心速度800-1200rpm，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40ml 进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞， 置37℃细胞培养箱中，经2-3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层， 备用；

(2)将步骤(1)制备的淋巴细胞单层进行传代培养，显微镜下观察步 骤(1)制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；

(3)鸭肝炎病毒的制备与提取：将鸭肝炎病毒接种于9-11日龄的鸡胚或 鸭胚尿囊液中，33℃-37℃温箱孵育，24h内死亡的鸡胚或鸭胚弃去，120h后 收集有明显痘斑的鸡胚或鸭胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后， 置于组织匀浆机内制成悬液，反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声 15-20min，4℃、5000rpm离心20-30min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液 经4℃、7000rpm离心20-30min，弃去沉淀，收集上清液，经4℃、25000rpm 离心20-30min，弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液 装入以15％、30％、45％、60％及80％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管， 超速离心，4℃、15000-20000rpm离心2-4h，根据鸭肝炎病毒的分子量确定鸭 肝炎病毒所在位置，吸出并置于-20℃—-40℃冰箱内保存备用；

(4)抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的制备：将步骤(2)传代的淋巴细 胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为100mg/L)和步骤(3)所得鸭肝炎 病毒(终浓度为1000-1500血凝单位/ml)诱导培养，离心培养2-3天后， 8000rpm、20-30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透 析18-24h，超滤除菌，即得到抗鸭肝炎病毒特异性转移因子成品。

所述的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，刺激鸡脾细胞和 鸡血淋巴细胞增殖的植物血凝素剂的质量浓度为50-100mg/L。