[发明专利]一种黄颡鱼微卫星家系鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类遗传育种的分子标记辅助技术，具体涉及一种利用荧光微卫星标记鉴定黄颡鱼家系的方法。

背景技术

黄颡鱼是我国江河、湖泊中的一种重要的经济鱼类，对生态环境适应性较强，广泛分布于我国淡水水体中。因其具有肉质细嫩，营养丰富，含肉率高，除脊刺外没有肌间刺等优点，颇受广大消费者欢迎。近年来，由于商品黄颡鱼主要靠天然捕捞，滥捕现象日益严重。加之湖泊河流受农药、工业废水等污染程度加剧之因素，黄颡鱼自然受到一定程度的破坏，保护黄颡鱼资源及相关的研究势在必行。黄颡鱼繁殖亲本主要是野生捕捞或培养数代的种群，没有经过人工选育,其生长速度、抗病能力和其它养殖性能等还未达到良种化的程度，适应集约化养殖能力较弱。因此，尽快开展黄颡鱼良种选育工作对于黄颡鱼种群保护和满足当前健康养殖业的迫切需要具有极其重要的意义。

在鱼类遗传育种研究中，清晰的系谱信息对于家系的选育和亲本的管理至关重要。传统的水产动物选择育种中，养殖单位需要对不同的家系进行分养来维持家系信息，所需水体大且不便管理。尤其需要考虑的是，每个分养池之间在环境因子上会存在一些差异，不同的环境因素会使育种相关的遗传参数估计产生偏差。此时可以把不同家系混养在一起,但是需对所有家系进行非常复杂的标记。在混合养殖群体中保持家系信息，大多数畜牧上的研究以物理标记为手段，而物理标记对于水产动物存在操作繁琐、对生长有一定影响及对幼体伤害较大等局限性。此外，黄颡鱼等无鳞鱼类受到物理标记损伤后容易发病而死亡。分子标记的出现使得混养亲缘关系的鉴定成为可能，以微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。已应用到罗非鱼、大菱鲆、凡纳滨对虾、牙鲆和鳜鱼等水产经济动物育种中。目前，尚未见将微卫星标记应用于黄颡鱼家系鉴定的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄颡鱼微卫星家系鉴定方法，以减少在黄颡鱼群体选育中存在的近亲繁殖现象。

该方法包括以下步骤：

1)黄颡鱼亲本和子代基因组DNA提取

剪取用于构建家系的黄颡鱼亲本的鳍条组织，以及将子代全鱼去头和内脏，采用醋酸铵法提取亲本和子代的基因组DNA，检测质量和浓度后，稀释至100ng/μl；

2)多态性微卫星标记筛选和引物合成

选取6对微卫星引物，按照片段大小分为2组，在正向引物的5’端分别用FAM(蓝色)、HEX(绿色)、TAMRA(黄色)三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；

3)微卫星位点基因分型及家系鉴定

采用荧光PCR反应对亲本及子代的DNA样品进行PCR扩增，扩增产物按照步骤2)中所选微卫星引物分组的方法进行混合，作为上机检测的样品，样品在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500作为内参，用GeneMarker V1.5软件读取每个样品的基因型，采用CERVUS 3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，

所述的6对微卫星引物的核苷酸序列分别为：

第1对：正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示；

第2对：正向引物如SEQ ID NO.3所示；反向引物如SEQ ID NO.4所示；

第3对：正向引物如SEQ ID NO.5所示；反向引物如SEQ ID NO.6所示；

第4对：正向引物如SEQ ID NO.7所示；反向引物如SEQ ID NO.8所示；

第5对：正向引物如SEQ ID NO.9所示；反向引物如SEQ ID NO.10所示；

第6对：正向引物如SEQ ID NO.11所示；反向引物如SEQ ID NO.12所示；

其中，第1、2、4对为一组，第3、5、6对为另一组；第1、3对采用FAM荧光基团进行修饰；第2、5对采用HEX荧光基团进行修饰；第4、6对采用TAMRA荧光基团进行修饰。

本发明具有以下优点：

1)首次在黄颡鱼上利用荧光标记的多态微卫星标记建立了亲子鉴定平台，其鉴定准确率达到了98.9％。本发明能快速、有效地鉴别黄颡鱼不同家系，为黄颡鱼的选育和繁殖配组提供了依据。

2)本发明按照微卫星荧光标记的颜色不同进行分组，将每组的3个微卫星位点产物混合在一起上样，比正常PCR检测方法提高了3倍效率，同时节约了成本和时间。