[发明专利]一种生长抑素的合成工艺

权利要求书

1.一种生长抑素的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成Fmoc-Cys(Acm)-树脂

称取0.83kg，100-200目，0.6mmol/g的2-CTC树脂，加入DCM洗涤3次，每次10min，加入DCM，室温搅拌溶胀；加入用DCM溶解的Fmoc-Cys(Acm)-OH，加入330ml DIEA，通入惰性气体，于22.5±2.5℃条件下反应24小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，得到肽偶合树脂；

(2)合成Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Ser(tBu)-OH，摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；

(3)合成Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Thr(tBu)-OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；

(4)合成Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Phe-OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；

(5)合成Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Thr(tBu)-OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；

(6)合成Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Lys(Boc)-OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；

(7)合成Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Trp(Boc)-OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；

(8)合成Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Phe-OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；

(9)合成Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Phe-OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；

(10)合成Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Asn(Trt)-OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；

(11)合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Lys(Boc)-OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；

(12)合成Fmoc-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Cys(Acm)-OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；

(13)合成Fmoc-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Gly-OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；

(14)合成Fmoc-Ala-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-树脂

再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc-Ala-OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl-HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，洗涤后用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到十四肽偶联树脂；

(15)肽树脂的裂解

取步骤(14)所得十四肽偶联树脂，按1g：10mL的比例加入裂解液，TFA：TIS的体积比＝95：5，搅拌反应2h，抽滤，除去树脂，滤液加入乙醚内沉降3h，离心得还原型线性粗肽；

(16)粗肽氧化

加水溶解粗肽固体，将粗肽配成1mg/ml的溶液，慢慢滴入碘的乙醇溶液，滴加完毕后搅拌，检测反应结束后加入过量的硫代硫酸钠，中和过量的碘，获得生长抑素粗品；

(17)精制纯化

初纯：流动相A：TFA/纯化水、B：色谱纯的乙腈，波长：230nm

洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到35％，保持35％直到洗脱结束；循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液；

精纯一步：流动相A相：HAC/TEA/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm

洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到26％，在40min内升到28％，保持直到洗脱结束，循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液；

精纯二步：流动相A相：HAC/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm

洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到19％，在20min内升到22％，在22％保持20min洗脱结束，循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液；

转盐：流动相A相：醋酸铵/纯化水；B相：乙腈，波长：230nm

梯度洗脱梯度：流动相B用5％转盐20min，洗脱流动相C：0.3％HAC水溶液，洗脱梯度：流动相B用5％平衡15min，在1min内升到25％，在25％保持20min洗脱结束；

收集所需要的流出液，去盐，除尽乙腈，冻干，即得。