[发明专利]一种猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

     本发明属于食品安全检测或者病原微生物检测领域，更具体涉及一种检测病原微生物的试剂盒，还涉及一种猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒的用途。适用于医疗卫生、食品和动物疫病的快速检测。

背景技术

     猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2,  S. suis 2）是一种重要的人畜共患传染病病原。S. suis 2不仅导致猪出现脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎和败血症等症状，造成猪只大量死亡，给养猪业造成巨大的经济损失，还可以通过与感染猪、带菌猪肉直接接触而传染给人，导致人永久性听力丧失、败血症型休克甚至死亡，严重威胁着人类的身体健康和生命安全，已引起社会的高度关注。1998年在江苏南通S. suis 2造成病死猪10万余头，人群感染25例；2005年四川省S. suis 2造成死亡猪几千头，人群感染208例。同期广东、香港也有病例报导。猪链球菌病已成为泰国的重要传染病，也是香港引起脑膜脑炎的第三大病原（仅次于肺炎链球菌和结核分枝杆菌）和越南引起脑膜脑炎的第一大病原。

    目前猪链球菌的检测方法主要有微生物学方法、免疫学方法和分子生物学方法等。在显微镜下猪链球菌呈圆形或椭圆形，常呈链状排列，长短不一，革兰氏染色阳性。猪链球菌在加有血液或血清的培养基中生长良好，在琼脂平板上培养可见表面光滑整齐的白色菌落。多数致病性猪链球菌具有溶血能力，在血平板上呈β溶血。微生物学方法检测方法操作过程比较繁琐，对操作人员要求较高，耗时且灵敏度较低。免疫学的检测方法包括血清凝集实验、酶联免疫吸附实验和协同凝集实验，这类方法对操作人员要求较高，耗时。近年来分子生物学的检测方法的发展较大程度上提高了病原检测的特异性和灵敏度，如特异性的核酸探针和PCR检测方法。然而，该类方法需要仪器设备，检测耗时，无法满足快速检测的需求。

     环介导等温扩增 （loop-mediated  isothermal  amplification，LAMP）是一种新型的核酸等温扩增技术， 该技术针对靶基因的6个区域设计6条特异引物， 利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在60～65℃恒温条件下反应几十分钟即可完成核酸扩增反应， 扩增出LAMP特征性梯状条带。在LAMP反应结束后加入荧光染料，可直接通过颜色变化来判定反应结果。LAMP技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性并缩短了检测时间； 特别是它不需使用昂贵的热循环仪，在等温条件下就能完成反应，且扩增产物用肉眼能观察，可用于病原微生物的现场快速检测。已广泛应用于细菌、寄生虫、转基因作物领域的检测，并取得了较理想的效果。适合基层推广检测；符合疾病检测的快速、准确的诊断需要。

通过检索有以下专利申请，CN1896279A公开了一种PCR法检测猪链球菌2型的方法，其中同时使用了3对引物进行PCR扩增，该方法需要PCR仪，只能在菌浓度为450个/mL以上时具有阳性结果。CN102605046A公开了一种试剂盒和检测猪链球菌2型的方法，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的5’端和/或所述下游引物的5’端被生物素修饰；所述探针的5’端和/或3’端被地高辛修饰；所述探针能够与所述双链DNA扩增产物中带有生物素修饰的单链DNA杂交，该方法特异性较强，但该方法操作复杂、检测耗费时间长，且其灵敏度具有很大的改进空间。CN103409546A公布了一种检测猪链球菌的试剂盒及应用，包括了细菌基因组DNA提取、CPS2J基因的LAMP扩增和电泳检测。所述的检测试剂盒所针对的检测靶CPSCPS2J基因的部分核酸序列存在于其他种属的细菌中，针对该靶点建立的猪链球菌2型检测方法的准确性受到影响。同时，所述的检测方法需要提取样本的基因组才能进行检测，耗时较长。

发明内容

     本发明的目的是在于提供了一种猪链球菌2型的SS2-LAMP检测试剂盒，能快速检测食品中或者动物携带的猪链球菌2型。与PCR检测方法相比，SS2-LAMP检测方法提高了检测的灵敏度并减少了检测时间。同时，在检测靶点的选择上进行了创新，SS2-LAMP检测方法与生物信息学结合，编写基因组比对程序高通量筛选出猪链球菌2型基因组中特有的靶序列，并设计相应的特异性引物，极大提高检测的准确性。此外，SS2-LAMP检测试剂盒不需要基因组提取步骤，提高检测效率降低检测成本。