[发明专利]一种利用幼胚拯救获得八仙花种间杂种的方法

权利要求书

1.一种利用幼胚拯救获得八仙花种间杂种的方法，包括以下步骤：

A、子房消毒：将授粉后60-75天的未完全发育子房切割下来，在0-8℃温度条件下，存放24-72小时后取出，用浓度为75%的酒精对其表面擦拭2-3次，流水冲洗2-6小时，带到超净工作台上；用75%的酒精浸泡30秒，0.05-0.1%升汞溶液中浸泡8-15min，用无菌水清洗5-6遍，选取膨大的子房，用无菌刀片切去子房基部。

2.B、接种：在无菌条件下，将灭菌后切去基部的子房接种到1/2MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，灭菌前PH调整到5.8-6.0；培养温度为21-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间12-14h/d，空气湿度70-85%，培养30-45天后萌发率达到30-40%。

3.C、增殖培养：将萌发的幼胚接种到1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5-1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，灭菌前PH调整到5.8-6.0；培养温度为21-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间12-14h/d，空气湿度70-85%的条件下进行幼苗的增殖培养，30-45天转接一次。

4.D、生根培养：将增殖获得的无菌幼苗转接到1/2MS+IBA0-0.5mg/L+AC0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，灭菌前PH调整到5.8-6.0；培养温度为21-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间12-14h/d，空气湿度70-85%的条件下进行生根培养，30-45天后统计生根率为100%。

5.E、杂种鉴定：对获得材料同时进行形态学鉴定和杂种SSR鉴定，其中：在形态学鉴定时，对杂种的父母本及后代材料的形态学进行观察和统计，包括：依据英国皇家园艺学会色谱比色，对父母本及开花后代的花色进行比对并记录；每株随机选择三片完全展开的叶片，进行叶长和叶宽的测定，并分别测定叶柄的长度；每株随机选择三个完全盛开的花序，测量其花序的长宽，并记录每个花序的着花数；每个花序随机选择五多单花，测量其单花的长度和宽度；每株随机选择五个花瓣，对花瓣长度和宽度进行测量。

6.其中花色与父母本的花色均不同，叶片长宽比、花瓣长度、宽度、长宽比及花序长宽比介于父母本之间的初步确定为真杂种。

7.在杂种SSR鉴定时，提取亲本及获得的杂交后代的DNA，对获得的DNA质量进行鉴定，接着进行PCR扩增及琼脂凝胶电泳获得扩增谱带，并对PCR产物进行检测，然后使用全自动ABI3730DNA自动测序仪对PCR产物进行STR分型。

8.根据SSR引物扩增条带读数结果，扩增结果较清晰反映出有子代发生重组现象；然后通过分析SM匹配系数进行的UPGMA法聚类结果发现无一子代与亲本相似系数为1，即无一子代与亲本完全相同。

9.而各子代之间的相似性系数变化范围在0.47-0.93，体现出各个子代间都存在一定的差异。

10.最后我们可以确定14个杂种子代为真杂种。