[发明专利]一种基因敲除载体在脐孢木霉菌基因功能研究中的应用

说明书

 

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，特别是涉及一种基因敲除载体质粒在脐孢木霉菌（Trichoderma brevicompactum）基因功能研究中的应用。

背景技术

脐孢木霉菌是一种广泛存在于土壤、植物中的木霉菌。木霉菌主要通过拮抗作用、竞争作用以及抗生作用等，对常见的多种病原真菌具有抑制作用，如黄瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）等，因而具有良好的生防应用前景。木霉素（Trichodermin）——单端孢霉烯类化合物的一种，它对常见9种植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发均有不同程度的抑制作用，对黄瓜立枯病和番茄灰霉病等真菌病害有良好的生防效果。据报道，木霉素主要由脐孢木霉菌合成，但目前木霉素在脐孢木霉菌中的合成途径尚未明确。探明木霉素的合成途径，对木霉素的工业生产和应用具有重要意义。

研究发现单端孢霉烯类化合物代谢途径中的相关基因大多位于tri基因簇中。镰刀菌（Fusarium）中tri基因簇的研究较多，该基因簇中大多基因的功能已经知晓，然而tri14基因功能尚未明确。苇状木霉（T. arundinaceum）也能合成单端孢霉烯类化合物Harzianum A（HA）。木霉素和HA的结构非常相似，唯一区别在于C-4位侧链基团的不同，木霉素C-4位是乙酰基团，HA 上是octa-2,4,6-trienedioic acid。在T. arundinaceum中，trichodiene 经加氧、环化、羟基化和乙酰化等4步反应最终合成HA。Tatri4催化3步氧化反应，Tatri11编码的酶催化C-4羟基化反应（Cardoza R E, Malmierca MG,  Hermosa MR, Alexander NJ, McCormick SP, Proctor RH, Tijerino AM, Rumbero A, Monte E, Gutierrez S. Identification of Loci and Functional Characterization of Trichothecene Biosynthesis Genes in Filamentous Fungi of the Genus Trichoderma. Appl Environ Microb,2011,77(14): 4867-4877）。脐孢木霉菌中相关基因的功能研究报道很少，除了tri5 基因外，其他基因的功能均有待研究（Tijerino A, Cardoza RE, Moraga J, Malmierca M G, Vicente F, Aleu J, Collado I G, Gutiérrez S, Monte E, Hermosa R. Overexpression of trichodiene synthase gene tri5 increases trichodermin production and antimicrobial activity in Trichoderma brevicompactum. Fungal Genet Biol, 2011,48:285-296）。

基因敲除是基因功能研究中最具有说服力的方法之一。传统基因敲除质粒载体构建方法是将待敲除基因上游，下游DNA片段和抗生素抗性基因片段分别通过酶切和连接的方法克隆到基因敲除骨架载体的多克隆位点上。传统构建基因敲除质粒，有两个弊端：（1）构建一个完整的基因敲除质粒，至少要做三次克隆，每一次克隆都需要重复酶切和连接转化等繁琐步骤，降低了工作效率；（2）只能选择在骨架载体多克隆位点中所对应的限制性内切酶，且选择的内切酶不能在待敲除基因的上、下游DNA片段和抗生素抗性基因中存在相应的酶切位点。而在实际操作中，在基因的上、下游DNA片段和抗生素抗性基因中可能存在较多的酶切位点序列，导致在多克隆位点中很难找到相对应的内切酶，限制了其应用。

发明内容

本发明从脐孢木霉菌0248菌丝体中提取基因组，利用融合PCR方法构建tri14基因敲除载体，并将该载体应用于tri14基因的敲除以及该基因功能的研究。