[发明专利]一种检测半枝莲多糖抗肿瘤机制的研究方法

权利要求书

1.本发明公开一种检测半枝莲多糖抗肿瘤机制的研究方法，其检测步骤包括：

a）体内抑瘤实验；

b)ANAE法测定荷瘤小鼠外周血T细胞总数；

c）流式细胞术测定荷瘤小鼠外周血中T细胞亚群及T细胞表面蛋白—CD28；

d）ELISA法检测荷瘤小鼠外周血血清中IL-2和IFN-γ的含量；

根据权利要求1所述的检测半枝莲多糖抗肿瘤机制的研究方法，其特征在于：所述步骤a）体内抑瘤实验按如下步骤进行：

1）小鼠随机分成6组，每组10只，分别为阴性对照组(生理盐水)；阳性对照组(黄芪多糖，环磷酰胺)；半枝莲多糖低剂量组、中剂量组和高剂量组；

2）无菌条件下抽取接种第7d的生长良好的S180荷瘤小鼠腹水(活癌细胞数>97%)，无菌生理盐水1∶3稀释，按0.2mL/只(细胞浓度约2×107个/mL)，无菌操作小鼠右前腋皮下接种；

3）半枝莲多糖高剂量组200mg/(kg·d)，中剂量组100mg/(kg·d)，低剂量组50mg/(kg·d)，阳性对照组给黄芪多糖100mg/(kg·d)，阴性对照组给同体积生理盐水；于接种24h后开始无菌操作腹腔注射给药，1次/d，连续给药7d，停药次日处死小鼠，分别称体重后，分别观察记录小鼠体重、瘤块重、胸腺及脾脏重量；

4)数据处理：

胸腺指数=胸腺重/体重

脾指数=脾重/体重

采用SPSS14.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组比较用t检验，p＜0.05表示差异有统计学意义。

2.根据权利要求1所述的检测半枝莲多糖抗肿瘤机制的研究方法，其特征在于：所述步骤b)ANAE法检测荷瘤小鼠外周血T细胞总数，在停药24小时后,小鼠尾静脉取血，推片，按如下步骤进行：

①用75%酒精将小鼠尾端局部消毒，待酒精干燥后用剪刀在尾端部约0.2-0.5mm处剪掉，待血液自行流出后，用玻片取血，推片；

②血片自然干燥；

③将血片置于4℃固定液中固定30s，取出后用自来水流水冲洗半分钟左右；

④将干燥后血片浸入孵育液中，37℃条件下浸染2h；

⑤取出后用流水充分冲洗血片上的沉淀物；

⑥用甲基绿对比染液染色30min；

⑦流水冲洗，空气干燥；

干燥后，油镜下计数400个淋巴细胞，算出T淋巴细胞的百分数。

3.根据权利要求1或2所述的检测半枝莲多糖抗肿瘤机制的研究方法，其特征在于：所述步骤c)流式细胞术检测荷瘤小鼠外周血T细胞亚群及表面蛋白—CD28，采用淋巴细胞三色荧光染色分析方法，试验设置如下：停药24小时后，眼眶静脉取血，每份血标本取两支试管，各100ul；在这两支待测的肝素抗凝血样本中一支分别加入Anti-mCD3-FITC/Anti-mCD4-PE-cy5/Anti-mCD28-PE，另一支则分别加入Anti-mCD3-FITC/Anti-mCD8-PE-cy5，/Anti-mCD28-PE，然后室温避光孵育15-20min，每管加入红细胞裂解液2ml，震荡混匀，避光10min，离心(1400r/min)5min，弃上清，PBS洗涤2-3次，2h内上流式细胞仪检测。

4.根据权利要求1所述的检测半枝莲多糖抗肿瘤机制的研究方法，其特征在于：所述步骤d）ELISA法检测荷瘤小鼠外周血血清中IL-2和IFN-γ的含量:停药24h后，眼球采血，室温凝固30min，离心(1000r/min)15min，收集血清，立即分析或分装后-20℃冷冻保存；用小鼠白介素2(IL-2)和小鼠γ干扰素（IFN-γ）ELISA检测试剂盒，将已知浓度的标准品和测试样品加入微孔酶标板内进行检测，将生物素标记的抗体同时温育，洗涤后，加入酶标抗体，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物工作液暗反应，加终止液终止；依标准品OD值分别做出标准曲线，用酶标仪于492nm处测定吸光值OD（A）。