[发明专利]小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞培养技术，尤其涉及一种小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化培养方法。

背景技术

在女性生殖系统恶性肿瘤发病中，卵巢癌的病死率最高，其生存率仅为30％。其主要原因是卵巢癌的早期诊断率低，恶性程度高，易转移，并且治疗过程中易产生耐药性。虽然已有的研究表明大约80％-90％的卵巢癌起源于卵巢表面上皮细胞，但是对于卵巢表面上皮细胞恶性转化的病因及其病理学过程目前尚不清楚。为了更深入掌握上皮细胞性卵巢癌的发生和病理学发展机制，需要了解卵巢表面上皮细胞恶性转化的过程，并建立一个小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化的研究模型。

虽然姚德生等人发表于《广西医科大学学报》2006年04期的论文“永生化正常小鼠卵巢上皮细胞系的建立”，提供了一种分离和培养具有“永生化”特性的小鼠卵巢上皮细胞(MOSEC)，但是其在论文中也指出，正常的卵巢上皮细胞体外培养生长不稳定、不宜传代，容易衰老停止分裂，因此该方法采用转入温度敏感抗原(TsAg)基因的CD1小鼠来进行MOSEC细胞的建立，也有相关文献指出，TsAg基因对于“永生化”细胞的培养有决定性的影响(P S Jat,C LCepko,R C Mulligan,and P A Sharp，Recombinant retroviruses encoding simian virus 40large T antigen and polyomavirus large and middle T antigens.Mol Cell Biol.Apr 1986；6(4):1204–1217.)，2002年，ARAKI Y等人利用同样的转入TsAg基因小鼠培养出“永生化的附睾细胞系”(ARAKI Y,et al.Journal of Andrology,2002,23(6):854-869)。虽然TsAg基因没有致癌性，但是毕竟转入TsAg基因的CD1小鼠不属于野生型的小鼠，对于卵巢表面上皮细胞恶性转化的病因及其病理学过程的研究有一定影响。现有技术中缺乏有效的手段，解决正常野生型小鼠的卵巢表面上皮细胞体外恶性转化这一问题。

除此之外，现有技术中对于小鼠卵巢上皮细胞的分离、培养方法，与野生型的小鼠卵巢上皮细胞也有所不同，例如姚德生等人分离培养的MOSEC细胞，其通过免疫组化反应检验为CK-19阳性、Vimentin阴性，而正常情况下MOSEC是一类包被卵巢表面的单层立方-长方形的上皮-间质双性细胞，其随着排卵而周期性破溃增殖，对排卵过程中卵巢表面破溃及排卵后卵巢表面修复具有重要作用(NELLY AUERSPERG et al.Endocrine Reviews 2001,22(2):255–288；NUZHATAHMED et al.Cell.Physiol.2007(213):581–588)，因而既表达上皮细胞标志物上皮细胞标志物角化蛋白(keratin)(如keratin7,8,18,及19)，又持续表达间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin)、N-cadherin及α-平滑肌蛋白，理论上MOSEC细胞免疫组化反应检验结果为Vimentin阳性。另外，1984年Nishita等人将二甲基苯蒽(DMBA)涂抹于大鼠卵巢表面并缝合，以用于卵巢癌的模型建立，36周后，近50％动物出现卵巢肿瘤，但DMBA同时诱导了输卵管、子宫内膜及子宫颈肿瘤。由此，DMBA诱导的卵巢癌模型不具有特异性，尚不可确定卵巢癌为原位癌，存在诸多缺陷。

有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，开发出一种小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化培养方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种没有转入致癌基因、获得永生化特性的TsAg基因或使用其它诱导因素，有效解决正常野生型小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化这一问题的小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化培养方法。

本发明的小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化培养方法，包括以下步骤：