[发明专利]一种抗MRSA群体感应agr系统反义脱氧核酶的应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种抑制MRSA群体感应agr系统的反义抗菌脱氧核酶及其制备方法和应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌与多种人类感染性疾病密切相关，如皮肤感染、呼吸道感染、甚至包括威胁生命的坏死性肌膜炎、坏死性肺炎等。目前治疗MRSA最有效的药物是万古霉素，然而随着耐万古霉素MRSA的出现，人们即将面临无药可用的境地，因此寻找新的特异性抗MRSA感染的新靶点及新策略成为细菌感染治疗领域的研究热点和难点。

人类滥用抗生素是导致细菌发生耐药的最主要原因之一，在持续的抗生素选择性压力作用下，细菌耐药是一个必然发生的事件，每一种新的抗生素一经问世，很快便会产生耐药。探索和研制不易诱导细菌产生耐药的抗菌新策略和新药物是当今世界各国科学家必须面对的紧迫研究课题。群体感应系统是广泛存在于细菌内的一种群体行为调控机制，它不仅控制细菌间的信息交流和细菌的多种生命活动，而且也是致病菌生物被膜形成、毒力因子释放、致病力大小，以及耐药性发生的重要调控系统。

agr是金黄色葡萄球菌主要的群体感应系统，控制着许多毒力基因的表达，与细菌的致病力密切相关。agr是一个双组份信号系统，由AgrA，AgrB，AgrC，AgrD及效应分子RNAIII构成。RNAIII是一个具有复杂二级结构的调节性RNA，在不同的葡萄球菌中RNAIII的结构高度保守。RNAIII一方面编码26个氨基酸的δ-溶血素，另一方面能够调节个别胞外蛋白和多功能调节子的转录。

反义抗菌剂突破以细菌蛋白为靶点的经典研究思路，以细菌体内致病、耐药、群体感应等相关基因为靶点，从阻断相关基因的表达入手，进而达到抑制或杀灭细菌的作用，为抗耐药菌治疗带来了新的希望。与经典的抗生素相比较，反义抗菌剂具备以下突出的优点：一、以细菌基因为靶点，特异性高；二、靶点明确，研发成本低，只需知道基因序列就可得到相应的反义药物；三、生产成本低，用常规的寡核苷酸合成技术就能合成。因而反义抗菌剂被认为是抗耐药菌感染最有希望的突破口，代表着21世纪分子治疗领域革命性的进展。

10-23型脱氧核酶能在RNA的A-U位点切割，可切割任何mRNA的起始密码AUG，从而调控蛋白质的表达。10-23型脱氧核酶是一种潜在的强有力的RNA特异性切割工具，在体外可应用于RNA限制性内切酶，在生物系统内，可在RNA水平上阻断靶基因表达。

发明内容

本发明的目的在于通过对MRSA群体感应agr系统效应分子RNAIII mRNA为靶点进行研究，提供一种反义脱氧核酶抗金黄色葡萄球菌agr系统的应用。

本发明的目的是这样实现的：

一种反义抗菌脱氧核酶DNAzyme23，序列为5′-TTAAACAACTCAGGCTAGCTACAACGACAA-3′，其中A为腺嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，G为鸟嘌呤核苷酸单体；下划线所示序列为10-23型脱氧核酶的催化核心；所有核苷酸均进行硫代修饰。

本发明通过试验研究DNAzyme23对MRSA菌株(LAC)群体感应agr系统效应分子RNAIII的影响，结果显示DNAzyme23能浓度依赖性地抑制靶基因RNAIII的表达、显著降低α-toxin的分泌。另外，功能学实验表明，DNAzyme23处理组的细菌培养上清对兔红细胞的裂解，与对照组相比明显降低。根据这些试验结果，本发明提供了上述反义抗菌脱氧核酶在制备抗耐药菌的药物中的应用。优选所述的耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

本发明所涉及的反义抗菌脱氧核酶具有如下优点和显著的进步：以金黄色葡萄球菌agr群体感应系统RNAIII效应分子为靶点，具有高特异性、低毒、安全、不易诱导细菌耐药性的增加等优点。能够有效阻断agr信号通路、并减弱细菌毒力。具体表现在：RT-PCR法检测发现，DNAzyme23能剂量依赖性地抑制LAC菌株RNAIII基因的表达；Western blot显示DNAzyme23能够显著降低α-toxin的分泌。

附图说明

图1DNAzyme对RNAIII表达变化的影响柱状图；***P＜0.001vs.control。

图2DNAzyme23对α-toxin表达的影响柱状图；*P＜0.05vs.control；**P＜0.01vs.control；***P＜0.001vs.control。