[发明专利]CemGPDH基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘油-3-磷酸脱氢酶基因GPDH及其应用。具体地，涉及该基因序列的获得和酵母表达载体的构建，以及其显著提高酵母脂肪酸含量方面的用途。

背景技术

目前，随着传统能源的过度消耗和日益增长的能源需求，能源问题日益严峻，可替代能源的研究和开发成为全球学者关注的热点。生物柴油主要以大豆、麻疯树等油料作物、废弃的厨余油脂、动物性脂肪以及基因工程改造过的微藻作为原材料加工成液体燃料，是可以替代传统石油燃料的优质新型可再生能源。而微藻由于含油量高，易于培养，单位土地油脂产量远高于其他油料作物，被认为是最有潜力的能源资源之一。

微藻繁殖能力强，对生长环境要求低，易于培养，光合作用效率高，含油量高，但目前微藻油脂代谢途径中关键酶基因的研究还相对较少^[1-2]。小球藻(Chlorella)是微藻中的一类，属于绿藻门小球藻属，是光合自养型球形单细胞绿藻，直径大约3-8微米。小球藻繁殖能力很强，含有丰富的营养元素，例如蛋白质、油脂、多不饱和脂肪酸、维生素、矿物质、食物纤维、核酸及叶绿素等，还含有多种生物活性物质，例如糖蛋白、多糖。小球藻是少数几个可用于大规模培养的微藻。

真核生物(例如小球藻)中，油脂的主要储存形式是三酰甘油(TAG)，由甘油-3-磷酸(G3P)和脂酰辅酶A为前体合成。甘油-3-磷酸脱氢酶(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)催化糖酵解过程中产生的磷酸二羟丙酮(Dihydroxyacetone phosphate，DHAP)与G3P之间的相互转变，产物G3P是合成TAG的重要原料，因此，GPDH是连接糖代谢和脂代谢的关键酶。

G3P是由甘油磷酸化而来，在植物中，淀粉通常作为光合作用的终产物被储存起来，甘油的主要来源是通过将淀粉分解的葡萄糖送入糖酵解过程，将糖酵解中间产物转化为甘油。而在微藻中，有些种类的微藻在积累淀粉的同时会产生大量的甘油，作为光合作用的终产物储存起来^[3]。因此，在微藻中，主要有两条不同的甘油合成途径，其一是利用光合作用直接合成甘油，另一条是通过分解储藏物质，将淀粉及蔗糖分解成为6-磷酸果糖，后转变为DHAP，再由甘油-3-磷酸脱氢酶催化，生成G3P，最后通过去磷酸化作用生成甘油^[4-5]。从微藻GPDH在油脂合成代谢中的位置上来看，GPDH所催化的由DHAP转变为G3P的反应是甘油合成途径的关键步骤，GPDH参与了线粒体G3P穿梭，为呼吸链提供电子，是G3P合成的关键酶之一，而G3P是TAG和磷脂合成的重要原料，并且GPDH连接了糖代谢和脂代谢，对植物体内油脂合成和能量代谢有重要作用。

根据GPDH在细胞内位置不同，将其分为三种类型同工酶——细胞质型GPDH(ctGPDH)，叶绿体型GPDH(cpGPDH)和线粒体型GPDH(mGPDH)。每种同工酶在细胞内偏好催化DHAP与G3P之间相互转变的正反应或逆反应，辅酶类型不同(以FAD或NADH/NADPH作为辅酶)，受不同条件诱导表达(渗透胁迫、热激、油酸胁迫等)，并且在不同物种中目前已发现的GPDH同工酶数量不同^[5]。

发明内容

本发明发现将来源于椭圆小球藻的CemGPDH基因转入酿酒酵母INVSC1后，可显著提高其主要脂肪酸组分的含量。在INVScI主要的四种脂肪酸组分中，棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)含量变化不显著，棕榈油酸(C16:1)提高了15.57％，油酸(C18:1)提高了13.53％。酵母细胞总脂肪酸的含量也提高了约10.07％。已有物种GPDH基因的研究基本都选择了酵母GPDH突变体来对其进行互补功能验证，甚少有用野生型酵母的。本发明选择野生型酵母在对椭圆小球藻GPDH基因进行功能验证的同时还发现了其对油脂合成的显著作用。在酵母中研究表明，CemGPDH基因转酵母株与对照组(转空载)相比，总脂肪酸含量提高了约10.07％，且其部分主要脂肪酸组分的含量也有明显提高，其中棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)含量变化不显著，棕榈油酸(C16:1)提高了15.57％，油酸(C18:1)提高了13.53％。酵母细胞总脂肪酸的含量也提高了约10.07％。单个基因使得总脂肪酸及各不同脂肪酸的含量达到这种程度的实属少见。

本发明提供了一个GPDH基因，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，这个基因来源于椭圆小球藻，该基因cDNA全长为1857bp。