[发明专利]一种检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽药残留检测技术领域，特别是检测谷物中草甘磷的酶联免疫试剂盒。

背景技术

随着农业科技的不断发展,我国很多制药厂能生产出高效、广谱、低毒的除草剂，草甘膦便是其中的1种。草甘膦为内吸传导型广谱灭生性草甘膦,主要通过抑制植物体内烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，从而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化，使蛋白质的合成受到干扰导致植物死亡。

但在我国农业生产发展中，由于只研究了草甘膦的除草作用，却没有研究中毒后的解救方法，所以草甘膦也给我国的畜牧业发展和人类带来一定的危害。

酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

发明内容

为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。

本发明检测草甘磷的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、草甘磷标准品、草甘磷抗体工作液、草甘磷酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。

本发明检测草甘磷的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、草甘磷标准品的制备、草甘磷抗体工作液的制备、草甘磷酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。

其进一步特征在于：所述的酶标板经由草甘磷抗原包被制备，具体步骤是将草甘磷半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将草甘磷包被抗原稀释成1：40000比例，100μL/孔，37℃避光孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150μL/孔，37℃放置1.5h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

草甘磷标准品浓度分别为0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg、2.7mg/kg、8.1mg/kg。

所述草甘磷抗体工作液是采用草甘磷人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。

所述草甘磷酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例，所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2mol/L的硫酸，所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，为0.1mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5%吐温-20，0.1mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

检测草甘磷的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法包括以下步骤：

(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液中；

(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(3)取包被有草甘磷抗原的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中，加入草甘磷酶标二抗工作液，50μL/孔，然后加入草甘磷抗体工作液，50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min；

(4)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；

(5)加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min；

(6)加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据）；

(7)以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中草甘磷的含量。

其中，所述待测样品用以下方法进行预处理：