[发明专利]一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂及其基因和其重组蛋白的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂及其基因和其重组蛋白的应用，属于生物医学领域。

背景技术

生物体中的蛋白酶系是维系生命的关键物质之一，但蛋白酶的不正常表达或释放也会导致机体产生严重的病变。有机体调节这些酶活的主要途径之一便是积累一定的特异性蛋白酶抑制剂，胰凝乳蛋白酶抑制剂就是其中一种。

胰凝乳蛋白酶抑制剂(Chymotrypsin Inhibitor,CI)广泛存在于微生物、豆科植物、禾本科植物、节肢动物和哺乳动物等的体内，主要作用是停止、阻止或降低胰凝乳蛋白酶活性。胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)又叫糜蛋白酶，是一种典型的丝氨酸蛋白酶，在生物体的多种组织和器官中发挥着非常重要的作用，也是一些病原生物或肿瘤细胞的重要病原因子。

根据结构、分子量等的不同，丝氨酸蛋白酶抑制剂分为不同类型，其中马铃薯蛋白酶抑制剂I(PI-1)家族是其中一亚种。马铃薯蛋白酶抑制剂I家族的来源不局限于马铃薯，在其他生物体(如：大麦、番茄)、动物(如：水蛭)中也有发现。这类蛋白质一般具有抑制胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶的活性，结构上，这类蛋白酶的分子量较小(60～90个氨基酸残基)，结构中不含二硫键。

单环刺螠(Urechis uniconctus)俗称海肠，是我国北方沿海特有的一种海洋螠虫类动物，是无管螠目在我国沿海分布的唯一种类。主要分布于我国渤海、黄海、俄罗斯、朝鲜半岛、日本北海道等地，山东胶州地区是我国海肠的最大产地。其个体粗大，肉嫩味美，体壁蛋白质含量高达22.84％，且富含多种人体必需氨基酸，具有极高的食用价值，又称“裸体海参”。同时，单环刺螠栖息于沿海沙岸潮间带下区及潮下带浅水区“U型”隧道内，能够在其他动物不能生存的富硫环境中生存，在作为提取海洋药用活性物质、保健品的原料方面也具有极大潜力。

发明内容

本发明的目的是基于上述理论和现有技术基础，提供一种利用重组表达技术制备的、来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂及其基因和其重组蛋白的应用。

本发明的技术方案是：

一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂，该胰凝乳蛋白酶抑制剂的蛋白质具有氨基酸序列SEQ ID No.1：

MATKEQWPELVGKSGEEAKAAIIAERPELEKVEICNELSPMTMDYRTDRVRIFVNNDGNVVNPPQTG。

所述的来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂，编码的单环刺螠胰凝乳蛋白酶抑制剂UCI01是单链多肽，含67个氨基酸残基，分子量约为7516Da，等电点为4.38，不含二硫键，没有明显的信号肽区域。

一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因，该基因具有序列表SEQ ID No.2中的碱基序列。

所述的来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因，该基因cDNA序列全长度为697bp，其中含有80bp的5`非翻译区，413bp的3`非翻译区和polyA尾巴，开放编码框为201bp。

一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用，该胰凝乳蛋白酶抑制剂基因的重组表达工程菌株EUCI01，实现所述基因的可溶性表达。

所述的来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用，EUCI01表达的重组蛋白，具有较强的胰凝乳蛋白酶抑制剂活性，其IC50为53nM。

所述的来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用，胰凝乳蛋白酶抑制剂活性，重组蛋白对pH稳定，同时具有温度稳定性。

所述的来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用，EUCI01表达的重组蛋白，能够对金黄色葡萄球菌产生抑制。

本发明的优点及有益效果在于：

1、本发明克隆得到一个单环刺螠胰凝乳蛋白酶抑制剂的cDNA序列，并利用重组方法纯化制备了具有胰凝乳蛋白酶抑制活性的蛋白质。从而，为后续应用奠定了基础。

2、本发明利用原核表达技术对该基因进行重组表达，获得的重组蛋白具有胰凝乳蛋白酶抑制剂的活性，其IC50为53nM。该重组蛋白具有较好的pH稳定性和一定的温度稳定性，对金黄色葡萄球菌具有抑菌效果。

附图说明

图1：重组蛋白的SDS-PAGE分析图。其中，1蛋白marker；2未诱导的EUCI01；3诱导后的EUC01；4纯化后的UCI01。