[发明专利]地克珠利的免疫胶体金检测卡及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及谷物食品中兽药残留检测技术领域，特别是涉及地克珠利的免疫胶体金检测卡及其制备方法。

背景技术

地克珠利（Diclazuril）属三嗪苯乙腈化合物，为类白色或淡黄色粉末，在二甲基甲酰胺中略溶，在四氢呋喃中微溶，在水、乙醇中几乎不溶。地克珠利是一种高效、低毒的广谱驱球虫药，对鸡、火鸡、鸭、鹅、孔雀、鹌鹑、兔等各种球虫具有良好的防治效果，每吨饲料添加1g，能有效地控制球虫病的爆发。鸡球虫是养禽业的常见寄生虫，给养鸡业造成严重经济损失。目前预防鸡球虫病的主要手段是实用抗球虫药进行化学防治和疫苗接种，长期药物预防一直是鸡球虫病防治的有效手段，其用药量大，约占各种药物添加剂总量的1/4。地克珠利是主要使用的抗球虫药物之一，国内实用也较为混乱。

随着药物在食品动物中的广泛应用，其残留问题已引起了广泛的关注。药物残留不仅因其毒副作用对人造成直接危害，更严重的问题是食品动物中残留低浓度的药物容易又到人类致病菌产生耐药性，从而不利于药物在人医临床的应用。因为开展地克珠利的残留研究十分必要。

现有技术对于地克珠利的检测主要是高效液相色谱法等检测方法，但这些技术的缺陷明显：设备昂贵、操作复杂、难以推广。所以，建立一种简单、有效、适合基层使用的测定方法是极其必要的。本发明的目的是研制一种更适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉的定性检测方法。

发明内容

针对以上情况，本发明的目的就是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种地克珠利的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决能快速、简便地检测出地克珠利的问题。

本发明的地克珠利胶体金检测卡，包括包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了地克珠利-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC胶板和塑料模具组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。

本发明的地克珠利胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现：

(1)胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl₄·3H₂O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

(2)抗体的预处理：将要标记的地克珠利抗体在1000r/min,4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml，过0.22μm滤膜；

(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4mL10%BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温低速（1500r/min）离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成地克珠利单克隆抗体胶体金标记物；

(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)地克珠利蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含地克珠利蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；

(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、地克珠利蛋白质偶联物稀释成1mg/mL，用划膜仪依次以1μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；

(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；

(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。

所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；