[发明专利]WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法

说明书

本发明公开了一种WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法，通过细胞培养、染色质免疫沉淀反应及数据分析、质粒构建与病毒转染、蛋白质印迹分析、细胞增殖能力测定、碱性磷酸酶和茜素红染色、裸鼠皮下进行细胞回植；发现WDR63基因在间充质干细胞骨向/牙向分化过程中的调控作用，以及在促进牙组织再生中的作用。本发明采用涉及组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化对间充质干细胞的基因活化和功能的调节作用、WDR63基因在间充质干细胞骨向/牙向分化过程中的调控作用、涉及WDR63基因在促进牙组织再生中的作用，得到WDR63可能在根尖牙乳头干细胞成骨分化中起促进作用。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法。

背景技术

牙病是人类最常见的疾病之一，而牙齿的缺失极大的影响了人们的健康和生活质量。现有的义齿修复手段虽已成熟，但由于其不具备生物活性，难以与天然牙齿相媲美，无法实现人类拥有“第三副牙”的愿景。为此，各国试图利用干细胞和组织工程技术来实现牙齿的重建。如何研制出一种具有生物学活性与功能并且能够在颌骨中重建牙周关系的牙齿修复缺失牙，是临床牙科医生和科研工作者共同期望解决的重大课题。随着口腔发育生物学以及组织工程技术的进展，牙齿再生研究各个层面的工作均已展开，而全牙组织工程的最佳策略是采用自体细胞，将牙齿及其周围组织(包括牙齿、牙周膜、牙槽骨等)同时进行构建，然后植入颌骨缺损区，以获得具有一定活力的牙齿。在牙再生研究领域中，干细胞是其重要的组成部分，干细胞是一类未分化的细胞，具有自我复制能力及向多分化潜能。目前主要用于牙齿组织工程的牙源性干细胞有成人牙髓干细胞、乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、根尖乳头干细胞、牙囊细胞。其中根尖牙乳头干细胞(SCAP)存在于牙齿根尖孔的牙乳头组织中，具有多向分化潜能，在体外可以诱导分化为成牙本质细胞、脂肪细胞及软骨细胞等，在体内可以形成牙髓-牙本质复合体样结构，SCAP在根部牙本质形成过程中发挥重要作用，是一种较好的牙齿组织工程种子细胞，可用于牙髓牙本质和生物学牙根的再生，具有良好且广阔的临床应用前景。同时牙髓中存在牙髓干细胞(DPSC)，牙髓干细胞能再生出牙髓牙本质样复合体，其中的矿化基质与其中 的牙本质小管及包含血管的纤维组织按照正常人体的牙髓-牙本质复合体层次排列。并且细胞具有显著自我更新能力和多方向分化能力，能在体内异位形成牙本质，还可分化成脂肪样细胞和神经样细胞。2003年Miura等首次发现并报道了从人的脱落乳牙中分离到的一种具有多分化潜能的干细胞。并将该干细胞命名为乳牙牙髓干细胞(SHED)。这类细胞同样具有高度增殖能力、一定的多向分化潜能和自我更新能力等生物学特性，可以向成牙本质细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向分化。牙周膜干细胞是来源于牙周膜的成体干细胞，能产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞，能够维持牙周膜功能的稳定，发挥生理性细胞更新和修复组织损伤的作用，牙周膜干细胞不仅能分化为成牙骨质细胞样细胞和成骨细胞样细胞，形成牙骨质样和骨样组织；而且还可分化为成纤维样细胞，形成类似天然牙周膜样的结缔组织，能形成组织形态、空间排列上类似于天然牙周膜牙骨质复合体的结构，提示这是一种可用于牙再生医学的有效骨再生的自体干细胞。牙囊是包绕成釉器周围的疏松结缔组织，起源于外胚间充质，在牙齿萌出过程中发挥着重要的作用。牙根形成时期，牙周组织(如牙骨质、牙周膜和牙槽骨)由牙囊前体细胞形成，牙囊干细胞可以分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、脂肪细胞。在找到可能的种子细胞之后，间充质干细胞定向分化的分子机制仍不清楚，这也限制了间充质干细胞的潜在应用。

在干细胞分化过程中建立特殊的基因表达模式可以详尽描述控制其过程的大量基因的表达与沉默。组蛋白共价修饰在调节染色质动力及功能方面起重要作用。甲基化，一种组蛋白的修饰类型，同时发生在赖氨酸和精氨酸残基上。这种类型的组蛋白修饰涉及各种生物进程，以及转录调节。目前，干细胞分化过程中与基因表达模式紧密联系的组蛋白修饰的图谱，仍未被广泛的研究。目前，一种体内组蛋白修饰的基因组作图的技术方法正发展起来，使得研究者关于组蛋白修饰的分布可以遵循一个广泛观点。这种方法是“CHIP onchip”，基于染色质免疫沉淀试验，利用感兴趣的基因组区域相一致的探针通过基因芯片杂交识别富DNA片段。