[发明专利]一种结合常压室温等离子体诱变方式高通量筛选重组酶高产枯草芽孢杆菌宿主的方法

权利要求书

1.一种结合常压室温等离子(ARTP)诱变方式高通量筛选高产重组酶(如碱性淀粉酶)B.subtilis突变株的方法，其特征为：

1)出发菌活化：将B.subtilis WB600进行划线培养，挑单菌落于新鲜的LB液体培养基中，37℃培养8～20h后，转接新鲜LB培养基，进行同步培养；

2)ARTP诱变处理：用无菌生理盐水洗涤菌体后再重悬菌体，适当稀释菌体浓度至10^6～8个/mL，吸5～15μL均匀涂于载片上，置于处理源下，进行诱变处理；

3)后培养：诱变处理过的菌液，立即放入新鲜的LB培养基中，后培养2～3h后，适当稀释菌体浓度为10^5～7个/mL，涂布于新鲜的LB平板上培养；

4)重组酶高产菌株筛选：将含有重组酶基因的重组质粒转化步骤3)中诱变获得突变体文库，得到含有重组酶重组质粒的B.subtilis WB600突变体文库；将文库中的突变体逐个点种于筛选平板(对于该专利中突变宿主筛选采用的重组碱性淀粉酶，其筛选平板为淀粉-台盼蓝营养平板)上，培养8～12h后观察透明圈大小，菌落小透明圈大的可能为高产碱性淀粉酶突变株；缩小筛选范围后，进行96孔板高通量筛选，最终进行摇瓶发酵验证高产菌株。

2.根据权利要求1所述的结合ARTP诱变和高通量筛选重组酶高产B.subtilis突变株的方法，其特征在于所述的2)中用无菌生理盐水洗涤2～6次，重悬制备菌悬液(OD₆₀₀约为15～45)；适当稀释OD₆₀₀在1.0～3.0之间，不致重叠效应影响诱变处理的均匀性；处理参数设置为：气流量6～14slm、射频功率60～140W、时间20～40s、距处理源距离2～3mm。

3.根据权利要求1所述的结合ARTP诱变和高通量筛选重组酶高产B.subtilis突变株的方法，其特征在于：所述3)中，进行2～3h后培养，使突变中伴随产生的DNA损伤获得修复，并使突变更加稳定。

4.根据权利要求1所述的结合ARTP诱变和高通量筛选重组酶高产B.subtilis突变株的方法，该专利中突变宿主筛选采用重组碱性淀粉酶作为模式酶，其特征在于：转化得到含有碱性淀粉酶重组质粒的B.subtilis WB600突变体文库，根据淀粉-台盼蓝营养平板周围透明圈大小得到高产突变株，所用的培养基成分为：可溶性淀粉0.5～1.5％、台盼蓝0.02～0.08％、NaCl 0.5～1.5％、Yeast Extract 0.2～0.8％、Tryptone0.5～2.0％、琼脂1.0～2.5％，酶活测定方法选用DNS法。

5.根据权利要求1所述的结合ARTP诱变和高通量筛选重组酶高产B.subtilis突变株的方法，其特征在于：利用96孔板进行文库中高产突变体的高通量筛选，所用发酵培养基成分及配制步骤为：先配磷酸缓冲液，分别称取1.5～3.0g KH₂PO₄和10.0～15.0g K₂HPO₄，定容至100mL；Yeast Extract 18.0～30.0g、Tryptone 8.0～16.0g，甘油2.0～6.0mL，溶于900mL水中；灭菌，待磷酸缓冲液冷却至60℃左右时，加入900mL培养基中，摇匀，待用。