[发明专利]一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛乳蛋白脂肪酸修饰物及其制备方法，具体涉及一种诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物及其制备方法。属于医药或功能食品制备技术领域，利用本发明制备的牛乳蛋白脂肪酸修饰物可诱导人乳腺癌细胞的凋亡，而对正常人乳腺细胞无显著影响。

背景技术

癌症已经成为危害人类身体健康的第一杀手，并成为全球最大的公共卫生问题之一，癌症发病率逐年上升，预计到2020年全球每年将有1600万新增癌症患者，每年有1000万人死于癌症（国际抗癌联盟UICC，2011）。

虽然世界各国对癌症的研究投入了巨大的财力、物力和人力，但总体来说对癌症的治疗研究进展缓慢，人类对绝大部分晚期肿瘤仍然束手无策，癌症治疗费用居高不下，因此，欧美等一些发达国家已逐步将研究的重心从治疗转向预防，越来越重视癌症预防药物以及抗癌功能食品的研究与开发。长期以来，我国将本就有限的卫生资源过度集中于晚期癌症的治疗，而忽视癌症的预防，每年癌症病人的医疗费用高达千亿，占全国医疗卫生总费用的20%以上。

世界卫生组织指出，三分之一甚至一半以上的癌症都是可以预防的。而且癌症预防的成本，也远远低于癌症治疗的成本。近些年来，癌症化学预防，即利用天然或者合成的化合物来阻止、减缓或者逆转癌症发生发展过程的手段，越来越受到重视。从食物中寻找各种抗癌因子并开发相应的预防药物或功能食品、辅助治疗食品等成为重要的课题。其中蛋白质及其结合物类抗癌物质由于无毒副作用，受到越来越多的关注和重视。

乳腺癌是严重威胁人们生命健康的恶性肿瘤之一，居女性恶性肿瘤发病率和死亡率的首位。我国发病率近五年来增长了三倍；在北京、上海、广州等大城市，其发病率以每年2%～8%的速度递增且趋向年轻化（中国抗癌协会，2011）。因此，开发针对乳腺癌高发人群的预防药物和抗癌功能食品具有重要的意义。

瑞典医学家Hakansson在研究母乳如何防止细菌及病毒粘附至婴儿呼吸道和胃肠道粘膜时，偶然发现了一个惊喜的结果：母乳中经不饱和脂肪酸修饰的乳蛋白能选择性地杀死某些癌细胞，而不会杀死正常细胞。此后一些研究者采用人乳蛋白通过体外制备的方法成功获得具有诱导细胞凋亡作用的人乳蛋白脂肪酸修饰物。然而，由于人乳白蛋白主要存在于人类母乳中，来源非常有限，难以较大规模的制备。如果能够采用牛乳蛋白代替人乳蛋白获得具有人乳蛋白脂肪酸修饰物类似的抗癌活性的牛乳蛋白脂肪酸修饰物，将为开发乳腺癌防治药物及抗乳腺癌的功能食品带来广阔的前景。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物采用不饱和脂肪酸通过阴离子交换层析技术对乳蛋白组分进行适当的分子修饰，形成乳蛋白脂肪酸修饰物，此修饰物经体外细胞模型试验，证明其可显著诱导乳腺癌细胞凋亡，但对正常乳腺细胞无显著影响。其制备方法包括如下步骤：

（1）在温室下，将乳白蛋白溶于0.05~1mmol/L EDTA，10~20mmol/L Tris-HCl，pH8.0~8.5溶液中，0~4℃过夜以去除Ca²⁺，经蛋白超滤管浓缩得到去折叠状态的脱钙α-乳白蛋白；蛋白质终浓度调节至50~120μM；

（2）在温室下，将不饱和脂肪酸（油酸或亚油酸）混合到无水乙醇中，超声充分溶解，制成脂肪酸储液；使用前取储液加入10~20mmol/L Tris-HCl（pH8.0~8.5），溶液内乙醇终浓度不超过2%（V/V），油酸或亚油酸的终浓度控制在500~1800μM范围；

（3）将步骤（2）所述的溶液加入至DEAE-Sepharose fast flow阴离子柱，采用NaCl梯度洗脱对脂肪酸进行分散；

（4）将步骤（1）所述乳白蛋白溶液加入至经步骤（3）所述脂肪酸预处理的阴离子柱中，并采用低离子浓度梯度：0.2M NaCl，10mM Tris，pH8.0~8.5洗脱分别除去未结合的脂肪酸和乳蛋白，然后经高盐缓冲液：1M NaCl，10mM Tris，pH8.0~8.5洗脱，洗脱液经3.5Ku透析袋除盐，至少换4次水，最后冷冻干燥即得牛乳蛋白脂肪酸修饰物。

上述的牛乳蛋白组分来自以新鲜牛乳或乳粉为原料分离纯化所得到的α-牛乳白蛋白或重组型α-牛乳白蛋白，其纯度达到电泳纯。

上述的不饱和脂肪酸为油酸或亚油酸。

上述的乳腺癌细胞包括雌激素受体阳性和雌激素受体阴性乳腺癌细胞。