[发明专利]检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括酶标板、吡虫啉标准品、吡虫啉抗体工作液、吡虫啉酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。

2.检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括以下步骤：酶标板的制备、吡虫啉标准品的制备、吡虫啉抗体工作液的制备、吡虫啉酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。

3.根据权利要求2所述的检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的酶标板制备方法为将吡虫啉半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到吡虫啉包被抗原，用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将包被抗原稀释成1：40000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150μL/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

4.根据权利要求2所述的检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：吡虫啉标准品的浓度分别为0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg、2.7mg/kg、8.1mg/kg。

5.根据权利要求2所述的检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的吡虫啉抗体工作液是采用吡虫啉人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。

6.根据权利要求2所述的一种检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的吡虫啉酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例，所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2mol/L的硫酸，所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，其为0.1mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其为含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

7.权利要求2所述的检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法的特征在于：预处理待测样品，取包被有吡虫啉抗原的酶标板，按序分别加入标准品/样本、吡虫啉酶标二抗工作液、吡虫啉抗体工作液各50μL/孔到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min，将孔内液体甩干，用洗涤工作液充分洗涤4~5次，每次间隔10s，拍干后加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min，加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据），以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中吡虫啉的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述待测样品用以下方法进行预处理：a、取20g样品，经组织捣碎匀浆后置于250mL三角瓶内；

b、加入40mL丙酮，超声波提取30min，加入16g无水硫酸钠，，震荡涡旋1min；

c、室温离心4000r/min以上，10min；

d.、取5ml上清液到离心管中，加入5mL二氯甲烷，在密封的容器里混合，震荡涡旋1min，室温离心4000r/min以上，10min；

e、取1mL上清液，加入1mL稀释后的样品稀释液充分振荡混合30s，混匀待测。