[发明专利]一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，也称B族链球菌，是兼性的革兰氏阳性球菌，是一种重要的人、兽及鱼共患病致病菌。鱼源无乳链球菌可引起鱼类败血症和脑膜炎，具有较高的致病率和致死率。现有的鱼源无乳链球菌的检测方法主要有常规的细菌分离培养鉴定法、普通PCR检测法、环介导等温扩增技术(LAMP)检测法等。细菌分离培养方法存在耗时和受样品污染等诸多因素的影响；普通PCR既无法对病原定量，又需要凝胶电泳，容易对环境造成污染；LAMP法虽然灵敏性高，但不能对病原进行定量；而荧光定量PCR技术通过在PCR反应体系中加入可嵌入双链DNA的荧光燃料，利用相应软件实时监测整个PCR进程中的荧光信号积累情况，对未知模板可进行定性和定量分析，该方法可实时检测、速度快、高通量、定量准确、灵敏度高、特异性好、自动化程度高，在病原微生物检测方面已得到广泛应用，目前，尚无荧光定量PCR方法用于检测鱼源无乳链球菌的相关报道。近年来，鱼类无乳链球菌病大面积爆发流行，该病缺乏有效的治疗方法，防止无乳链球菌的传染和流行是当前采取的主要措施，早期快速检测该病原是减少损失的有效途径，荧光定量PCR技术应用于水产动物无乳链球菌的检测，对于疾病的预防意义重大。

发明内容

为解决背景技术中的检测临床样品中鱼源无乳链球菌的问题，本发明提供一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，该方法可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出水产养殖动物感染无乳链球菌，为防止鱼源无乳链球菌的传染和流行提供技术支持。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

(1)取患病鱼的组织50～100mg，称重后，放入组织匀浆器中研磨，加入1000μL TE缓冲液，制成组织匀浆液。取组织匀浆液180μL，加入20μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，30℃孵育10min；后续的提取步骤按照细菌DNA提取试剂盒法的方法进行，即得到高纯度细菌基因组DNA，保存于-20℃备用。

(2)根据GenBank中的鱼源无乳链球菌16S-23S rRNA基因间区序列，设计一对特异性引物，序列如下：

上游引物ISR-s：5′GGAAACCTGCCATTTGCGTCT-3′；

下游引物ISR-a：5′AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3′。

(3)使用上述特异性引物扩增出大小为190bp的片段；通过连接、转化将该片段插入18-T载体；最后对18-T重组质粒进行鉴定。

(4)提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用Thermo NanoDrop 2000进行质粒浓度检测，计算出重组质粒的拷贝数，将质粒进行10倍稀释法稀释成6.04×10⁸～6.04×10¹拷贝/μL的8个浓度梯度，将其作为标准质粒模板。

(5)将标准质粒作为模板，构建反应体系，进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线和标准曲线。

(6)将已经计算出拷贝数的重组质粒进行10倍梯度稀释，选取6.04×10⁴～6.04×10^-1拷贝/μL的6个浓度梯度，进行荧光定量PCR检测，以此确定荧光定量PCR所能检测的最低模板拷贝数，验证本发明方法的灵敏性。

(7)分别以无乳链球菌感染的罗非鱼、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、海分枝杆菌、鰤鱼诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、健康罗非鱼和健康斑点叉尾鮰的DNA，以及人DNA标准品为模板，进行荧光定量PCR扩增，验证本发明方法的特异性。

其中本发明所述步骤5-7中，所述的荧光定量PCR反应体系如下：总反应体积20μL，其中SYBR Green I PCR Master Mix预混液(2×)10μL、10μM上、下游引物各0.5μL、模板DNA 1.0μL、无菌水8.0μL；反应程序为：预变性94℃，1min，1个循环；随后进行40个循环，程序为94℃，30sec，退火60.4℃，20sec，延伸72℃，20sec，同时设溶解曲线反应参数为94，15sec，60℃，30sec，94，15sec。