[发明专利]一种猪Sox6蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.以含猪Sox6基因完整编码区的pMD19T-pSox6质粒为模板PCR扩增猪Sox6基因；

b.构建用于表达猪Sox6蛋白的大肠杆菌重组表达载体；

c、利用步骤b所得的重组表达载体经化学法转化到大肠杆菌株Rosetta(DE3)中，构建重组表达菌株；

d.培养步骤c所得重组表达菌株至OD₆₀₀达到0.4-0.6，加入诱导剂IPTG，诱导表达猪Sox6蛋白；

e.纯化诱导表达的猪Sox6蛋白。

2.如权利要求1所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于步骤a中，用于PCR扩增的上游引物为5’-CCCAATTCCATATGTCTTCCAAGCAAGCCACCTCTC-3’，下游引物为5’-AAACTCGAGGTTGGCACTGACAGCCTCTGG-3’。

3.如权利要求1或2所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于步骤a中PCR反应体系为：ddH₂O 20μl，上下游引物各1μl，cDNA 3μl，2×TaqPCR master mix 25μl；PCR反应条件为：95℃预变性3min，然后进行95℃30s，55℃30s，72℃3min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

4.如权利要求1所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于步骤b中所使用的大肠杆菌表达载体为pET-30a(+)，克隆猪Sox6基因的插入位点为Nde I和Xho I酶切位点。

5.如权利要求4所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收，回收产物用Nde I和Xho I限制性内切酶双酶切后连接到经同样双酶切的大肠杆菌表达载体pET-30a(+)的Nde I和Xho I位点上。

6.如权利要求1所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于所述步骤d中，诱导表达条件为IPTG终浓度1.0mmol/L，诱导表达5小时。

7.如权利要求1或6所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于步骤d、e中诱导纯化方法为：将步骤c中的Sox6重组表达菌株按照1:500接种到4ml LB液体培养基中，37℃、250rpm震荡培养过夜，按1:100比例转接到50ml LB液体培养基中，37℃、280rpm至菌液OD₆₀₀达到0.4-0.6，采用诱导表达条件为IPTG终浓度1.0mmol/L，诱导表达5小时，表达完成后，10000rpm离心10分钟后弃上清，收集沉淀，向沉淀中加入3ml的盐酸胍裂解液裂解1小时至溶液澄清，10000rpm离心15分钟，收集上清，上清经0.45μm滤膜过滤后，使用镍柱亲和层析法对猪Sox6蛋白进行纯化，收集纯化蛋白，﹣80℃保存备用；

其中，所述LB液体培养基中含有50μg/ml卡那霉素；所述盐酸胍裂解液含100mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠、6M盐酸胍，pH为8.0。

8.如权利要求1所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于，所述猪Sox6蛋白C端带有6个组氨酸标签。

9.一种猪Sox6多克隆抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求1-8制得的重组猪Sox6蛋白作为抗原免疫Sprague-Dawley大鼠，第一次免疫采用300μg重组猪Sox6蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后注射大鼠，2周后用200μg重组猪Sox6蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后第二次免疫大鼠，在以后20天内再次进行2次加强免疫，每10天1次，总共4次免疫，最后一次免疫7天后采血，收集抗血清。

10.如权利要求9所述的猪Sox6多克隆抗体的制备方法，其特征在于在免疫前对大鼠端尾采血3ml，收集血清作为阴性血清，以阴性血清作为阴性对照，用ELISA法对猪Sox6多克隆抗体进行抗体效价评定、用Western blot法评定抗体特异性。

11.一种根据权利要求9所述的猪Sox6多克隆抗体的制备方法制备的猪Sox6多克隆抗体。