[发明专利]适用于多基因型的豇豆高效再生体系的建立方法

权利要求书

1.适用于多基因型的豇豆高效再生体系的建立方法，其特征在于：包括如下步骤：

    1）前处理：将豇豆种子进行灭菌，然后放入含6-BA或TDZ的MSB₅培养基进行培养，培养时间为5天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度为1-4mg/L，TDZ的浓度为0.001-0.1mg/L；

    2）不定芽的诱导：切取带一个子叶的子叶节，然后放入含6-BA 和 KT或含KT 和 IBA的MSB₅培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度为0.8-1.2mg/L，KT的浓度为0.02-0.1mg/L，IBA的浓度为0.15-0.25mg/L；

    3）继代培养：将步骤2）所得物的不定芽的腋芽切下，弃掉，然后将剩余物接种于含6-BA 和 KT或含KT 和 IBA的MSB₅培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天；

    4）不定芽的伸长：将步骤3）所得物放入含6-BA和IBA的MSB₅培养基进行培养，培养时间为14天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度为0.5mg/L，IBA的浓度为0.1-0.3mg/L；

    5）生根培养：将步骤4）所得物的不定芽切下，接种在含生根培养基的培养瓶上培养，培养时间为14天，培养温度为保持在23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，所述生根培养基为MS培养基添加30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH=5.8；

    6）炼苗：选取经步骤5）培养后的根长为4-5 cm的健壮小苗，将培养瓶的盖子先拧松放置2天，再半开2天，然后再全开2 d，半开和全开盖子期间需要不断补充水分；

    7）移栽：将炼苗完成后的植株拔起，用水洗净根部培养基，移栽到装有泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的营养钵中，在23-27℃下，套上保鲜袋置于人工气候箱中保湿培养2 d，1-2周后再移到室外进行培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）所述的灭菌过程为：在超净工作台上，对豇豆种子先用75%的酒精浸泡消毒1min，再用0.1%升汞浸泡消毒5min，最后用无菌水冲洗5次。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中，在切取带一个子叶的子叶节时，节点距上胚轴0.5 mm，距下胚轴5 mm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤7）所述营养钵中泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的质量比为1:1:1:1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中的MSB₅培养基含有6-BA，6-BA的浓度为3mg/L；步骤2）中的MSB₅培养基含有6-BA 和 KT，6-BA的浓度为1.0mg/L,KT的浓度为0.06mg/L；步骤4）中的MSB₅培养基中，6-BA的浓度为0.5mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L。