[发明专利]一种表达透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

透明质酸酶是一类特异性水解透明质酸的水解酶，广泛存在于真核生物和原核生物中，主要水解透明质酸，是一种重要的生理活性物质。在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生。许多病理变化过程往往伴随着透明质酸酶和透明质酸的变化，暗示它们可能起着重要的作用。同时透明质酸酶也可以改变机体内一些药物和生理活性物质的分布状况。

透明质酸酶于1928年被Duran Reynals发现并称为扩散因子，1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)。根据透明质酸酶作用的底物特异性和催化机制，将其分为三类。第一类是来源于哺乳动物的透明质酸4-糖基水解酶家族，这类透明质酸酶(EC3.2.1.35)是具有水解和转糖苷活性的糖苷酶，通过水解透明质酸(HA)的β-1、4-糖苷键，产物以四糖透明质酸分子为主。也可作用于硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素产生硫酸皮肤素产物。第一类中比较常见的有来自于哺乳动物的睾丸、蛇毒、蜂毒以及溶菌体的透明质酸酶。第二类为微生物透明质酸酶，这类透明质酸酶(EC4.2.2.1)通过β-消除反应裂解HA的β-糖苷键，产生以不饱和的双糖分子为主要产物。这类透明质酸裂解酶来源于包括Clostridium,Micrococcus,Streptococcus,and Streptomyces等微生物，并且它们的底物特异性也不同。第三类代表性的透明质酸酶主要来源于水蛭，这类水蛭来源的透明质酸酶(EC3.2.1.36)属于透明质酸3-糖基水解酶家族，通过水解HA的β-1、3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。水蛭来源的透明质酸酶对底物的专一性强，对硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性。

透明质酸水解酶作为一种药理活性物质在临床上具有比较广泛的用途。1941年Hirst首次证实水蛭透明质酸酶强有力的抗菌性。水蛭透明质酸酶能溶解体内和体外细菌被膜并形成抗体，从而使宿主获得很好的药物治疗效果。透明质酸酶能够降解心肌透明质酸，显著减少间隙体积，阻止由缺血引起的动脉阻力增大，增加血流量。相关研究实验也证实透明质酸酶对治疗心肌梗塞效果显著。另外，透明质酸酶在抗肿瘤方面也具有重要的作用，恶性组织经透明质酸酶处理后粘多糖含量增加，有利于肿瘤细胞结合更多的抗癌药物。如它可以加强阿霉素对乳腺癌的抗癌能力，降低膀胱癌的复发率等。此外，透明质酸酶在临床上也作为药物扩散助剂，眼科手术后用于降低眼内压，与麻醉剂利多卡因盐酸盐配合使用，可加快进入麻醉状态和延长麻醉时间。虽然哺乳动物透明质酸酶作为“扩散因子”被广泛应用于药物扩散助剂，然而这类透明质酸酶活性易受肝素抑制。相比水蛭透明质酸酶活性不受肝素影响，在临床上作为“药物扩散因子”、治疗血栓、青光眼和其它药用方面具有更大的应用价值。水蛭来源的透明质酸酶由于其底物专一性强，与其它来源的透明质酸酶相比，它不能降解软骨素或硫酸软骨素，活性不受肝素影响。因此，理论上来讲，水蛭透明质酸酶用于临床药用更具医疗价值意义。

目前市场供应的透明质酸酶来源于动物组织提取，成本较高，酶活单位低(10²-10³U/mg)，而且具有动物病毒交叉感染的风险。然而，尚无水蛭来源的透明质酸酶基因的相关报道。水蛭来源的透明质酸酶是以活体水蛭组织进行提取为主获得，且每个水蛭提取所获得透明质酸酶仅约为230U。水蛭原料的来源和提取分离步骤的繁琐等因素都极大的限制了水蛭透明质酸酶在医疗和科研上的广泛应用。基于医疗卫生安全考虑，本发明以食品级工程菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重组发酵生产水蛭透明质酸酶。枯草芽孢杆菌由于具有诸多优势，例如安全、好氧生长、营养条件低、遗传操作工具完善等。本发明提供的重组微生物工程菌株高效生产制备水蛭透明质酸酶的方法，打破了水蛭透明质酸酶的活体水蛭提取纯化的瓶颈。对实现工业化生产和医疗科研应用水蛭透明质酸酶奠定了坚实的基础。

发明内容

本发明提供了一种高效分泌表达活性水蛭透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌。