[发明专利]大肠埃希氏菌YPC-SA-1及其应用

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物育种及其发酵技术领域，涉及一种大肠埃希氏菌YPC-SA-1及其应用。

背景技术

丁二酸，又名琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。丁二酸作为TCA循环的中间产物以及厌氧代谢的终端还原产物之一，在生物代谢过程中占有非常重要的地位。近年来的研究结果表明丁二酸还可以作为C4平台化合物合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等大宗化学品以及合成聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解聚酯。

近年来，随着化石资源的日益枯竭和环境问题的日益严重，采用生物法制备丁二酸备受瞩目。生物合成丁二酸，是利用细菌，真菌等各种微生物，以葡萄糖或其他各种水解液为碳源，经微生物发酵生产丁二酸。

发酵菌株是丁二酸生物合成的关键点之一，多数细菌和真菌都能产生丁二酸，但是只有部分菌株可产生高浓度的丁二酸，丁二酸工业生产菌包括一些丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌。目前，丁二酸工业发酵菌株的研究主要集中在产丁二酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)，产丁二酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)和大肠杆菌(Escherichiacoli)等。其中Escherichiacoli由于遗传背景清楚，基因操作简单，生长速度快，易调控以及所用培养基较为廉价，近年来成为生物法制备丁二酸的研究热点。

大肠杆菌作为兼性厌氧菌，其有氧条件下的比生长速率及细胞密度均高于厌氧，因此采用先有氧快速获得高密度的菌体细胞，进而厌氧发酵生产丁二酸的两阶段发酵模式可以大幅度提高丁二酸的生产速率。针对两阶段发酵过程中大肠杆菌代谢途径进行分析，发现理论上在不添加额外电子受体的条件下，重组大肠杆菌的收率可达到理论最大值1.12g/g，高于专一性厌氧发酵时的理论收率。而且，两阶段发酵过程可分别针对有氧生长和厌氧产酸阶段进行分阶段调控，更有利于丁二酸的生产。

中国专利CN201210138292.6公开了一种产丁二酸的大肠杆菌BER108（公开号102643770A，保藏编号CCTCCNO：2012068）。然而，在实际应用中申请人发现，在菌株有氧培养生长阶段，其生长情况在以工业级原料配置的培养基中明显慢于以分析级原料配制的培养基，表现为延滞期较长，总的有氧培养时间也较长。在工业化生产过程中，采用分析级原料进行生产不具有可行性，而采用工业级原料则需要更长的培养时间，从而增加人力、能耗等，最终导致产品成本的增加，因而不利于实际的工业化生产。通过改良菌株，使其可以在有氧条件下快速适应工业级原料，缩短有氧培养时间，在今后的丁二酸工业中具有举足轻重的作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种大肠埃希氏菌，能够在有氧生长阶段快速适应并利用工业级原料配制的合成培养基生长，缩短延滞期和总的有氧培养时间，达到在分析级原料培养基的生长水平。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）YPC-SA-1，其保藏编号为：CCTCCNO：M2014178。

本发明所述的大肠埃希氏菌EscherichiacoliYPC-SA-1的筛选方法，将大肠杆菌的出发菌株EscherichiacoliBER108（保藏编号CCTCCNO：2012068）经等离体诱变后，利用工业级原料配置的合成培养基平板筛选得到能够在有氧条件下生长快速的菌株，再经过5LNBS发酵罐筛选获得可以快速适应并利用工业级原料生长的目标菌株。

具体步骤如下：

1）等离子诱变：将大肠杆菌原始菌株BER108在试管中活化，37℃，200r/min，过夜培养；得到的菌液用无菌生理盐水稀释至OD₆₀₀=1.0，滴加在无菌载片上，用无菌风吹干；以氦气为放电气体，以80~120W为射频功率，以10~30SLM作为气体流量，以10~30s为辐照时间，对菌株进行等离子体诱变；

2）合成培养基平板初筛：将诱变后的载片置于装有1mL的生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌液洗脱，稀释成不同的浓度涂布于合成培养基平板上，37℃有氧培养12h；挑选生长较大，较为饱满的菌落；