[发明专利]高纯度替考拉宁精粉的纯化方法

权利要求书

1.一种高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将替考拉宁发酵液离心除去发酵液中的固体，得到含替考拉宁的滤液；

(2)将所述滤液进行大孔吸附树脂柱层析，先采用纯水以10L/h的流速洗脱，再用体积比10:90，15:85，20:80，25:75，70:30的丙酮-水溶剂系统以12L/h的流速进行梯度洗脱，收集以70％丙酮水溶液为洗脱剂的洗脱液，并浓缩，得到浓缩物；

(3)将所述浓缩物经过凝胶层析柱过滤，先用体积比10:90或15:85的甲醇-水洗脱；再用体积比35:65或40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液进行洗脱；收集以35:65或40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液为洗脱剂的洗脱液，浓缩以获得浓缩液；

(4)往浓缩液中加入丙酮沉淀30min，得替考拉宁粗品；用水溶解替考拉宁粗品，并加样至反相硅胶层析柱进行层析，先用15％乙腈水溶液洗脱2h，再用30％乙腈水溶液洗脱1.5h，最后用46％乙腈水溶液洗脱，分段收集，通过HPLC检测各段洗脱液中替考拉宁各组分的纯度，将满足纯度要求的洗脱液合并；

(5)往洗脱液中加入1.5～2.5％(w/v)的活性炭脱色20min，过滤，冷却沉淀除去杂质，加入6倍于上清液体积的丙酮于上清液中沉淀，低温结晶得晶体，晶体经红外干燥，得到替考拉宁纯品。

2.如权利要求1所述的高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：所述(1)的具体操作方法如下：

将替考拉宁发酵液调pH至11.0，室温保持15min，再回调至PH7.5，然后4500rpm离心10min，取上清液稀释至2倍体积。

3.如权利要求1所述的高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂为HP20树脂、D3520树脂、HZ816树脂或AB-8树脂。

4.如权利要求1所述的高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：所述(3)中的凝胶层析柱是指葡聚糖凝胶层析柱或琼脂糖凝胶层析柱。

5.如权利要求1所述的高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：所述(4)中的反相硅胶层析柱为C8反相硅胶层析柱或C18反相硅胶层析柱。

6.如权利要求1所述的高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：

所述(4)中，所述46％乙腈水溶液中含有3.15g/L的NaH₂PO₄，pH为6.5，且采用磷酸调节pH；所述15％、30％乙腈水溶液中均含有4.10g/L的NaH₂PO₄，pH为6.5，且采用磷酸调节pH。

7.如权利要求1所述的高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：所述(4)中的通过HPLC检测各段洗脱液中替考拉宁的纯度，其具体操作方法如下：

色谱柱为Ultimate Welch-C18；色谱柱规格是5μm、250mm×4.6mm；流动相A为体积比900:100的3g/L NaH₂PO₄-乙腈，流动相B为体积比300:700的3g/L NaH₂PO₄-乙腈；采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，进样量为10μL；其中，流动相A和流动相B按下述比例梯度洗脱：