[发明专利]周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法。

背景技术

淋巴丝虫病是全球最古老的疾病之一。据埃及开罗博物馆展示的4000年前的古埃及法老塑像，显示患有右下肢象皮肿，即为该病典型临床表现之一。据WHO报告，全球有83个国家和地区共有淋巴丝虫感染者约1.2亿，其中班氏丝虫病约1.07亿,马来丝虫病和帝汶丝虫病共约1300万。这些感染者中约4400万有淋巴丝虫病的临床表现，约7600万为微丝蚴血症者。估计全球有受威胁人口超过11亿，约占世界总人口的20％。我国曾是全球淋巴丝虫病流行最严重的国家之一，受威胁人口达3.3亿。虽然丝虫病的防治在全球范围内取得了巨大的成绩，但由于气候变暖等自然、生物和社会以及淋巴丝虫的夜现周期性和微丝蚴血症者多无临床症状等诸多因素的广泛存在，近年来在一些国家和地区出现疫情复燃和蔓延的趋势，丝虫病的流行不仅给人民的健康带来严重危害，也成为因病致贫的重要原因之一。最新研究报道表明，感染者残存传染源的微丝蚴血症可持续20年以上，中等密度和较高密度微丝蚴血症者具有传播丝虫病的作用。所以后期的监控与防治任务仍很艰巨。

在我国流行的主要是班氏丝虫和马来丝虫。后者生活史较复杂，主要包括幼虫在蚊体内和成虫在人体内的发育过程，此外还可在人体以外的多种脊椎动物体内发育成熟。淋巴丝虫病可导致患者永久或长期致残，被WHO列为世界第二大致残病凶。寻找控制丝虫病疫苗的研究越来越受到人们重视。筛选有效的保护性抗原并有机结合以获得最佳保护效应是疫苗研究的一个重要内容。肌球蛋白(myosin)是一种广泛存在于真核生物中的功能蛋白,不仅存在于肌细胞中，而且在非肌细胞中也存在。它作为生物体的一种重要的收缩蛋白质，在调节肌肉收缩和细胞重组等方面发挥着重要作用。有关寄生虫myosin的分子生物学和免疫学方面的研究表明它是一种早期免疫显性分子，具有较显著的免疫原性，免疫动物可产生较强的免疫保护作用。这也是研究者致力于myosin分子疫苗和药物研究的原因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方法简便、易操作，效果好的周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法。

本发明的技术解决方案是：

一种周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的制备方法，其特征是：包括下列步骤：

(一)引物设计

根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因(的高度保守序列区,应用Primer Premier5.0软件设计引物,并分别引入Xho Ⅰ/BamH Ⅰ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基；

P1:上游5’‐CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T‐3’

下划线序列为BamH Ⅰ酶切位点   Tm＝56.84

P2:下游5’‐CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG‐3’

下划线序列为Xho Ⅰ酶切位点   Tm＝66.90

(二)周期型马来丝虫虫体及微丝蚴的收集和总RNA的提取和测定

(1)将取自长爪沙鼠腹腔液的成虫及微丝蚴移入1.5ml匀浆器中,加入1mlTrizol试剂研磨,室温静置5min；

(2)加入0.2ml氯仿,震荡15s后静置2min,4℃,12000rpm离心15min取上清；

(3)加入0.5ml异丙醇混匀,室温静置10min,4℃,12000rpm离心10min弃上清；

(4)加入1ml 75％乙醇混匀,4℃,9000rpm离心5min弃上清；

(5)干燥5min后溶于DEPC处理水30ul,60℃10min；

(6)取2ul总RNA稀释200倍,在紫外分光光度计上测OD260和OD280值,确定其浓度和纯度,并进行甲醛电泳检测；

(三)cDNA的合成

(1)取总RNA 5ul,后加入10mM dNTPmix 1ul,0.5ug/ul oligo(dT)12‐18ul,DEPC处理水3ul,65℃加热5min,后冰浴5min；

(2)另取10×Buffer 2ul,25mM MgCl24ul,0.1M DTT 2ul,RNA酶抑制剂1ul混匀,42℃孵育2min；

(3)将步骤(2)混合液加入步骤(1)物质中混匀,再加入1ul逆转录酶Superscript Ⅱ混匀；42℃孵育50min,70℃15min终止反应,‐70℃保存备用；