[发明专利]一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记及应用有效
申请号: | 201410566923.3 | 申请日: | 2014-10-22 |
公开(公告)号: | CN104313149A | 公开(公告)日: | 2015-01-28 |
发明(设计)人: | 熊秋芳;张雪丽;张小康;张雪清;徐长城 | 申请(专利权)人: | 武汉市蔬菜科学研究所 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10 |
代理公司: | 武汉宇晨专利事务所 42001 | 代理人: | 张红兵 |
地址: | 430345 湖北省武*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 适用于 检测 萝卜 叶缘裂刻 性状 分子 标记 应用 | ||
1.一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记,它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.一种扩增权利要求1所述的分子标记的引物对,其DNA序列如下所示:
正向引物5’-ACTGGTTATCTTGTGGTGATGGAAAC-3’,
反向引物5’-AAGTCGGTTTGGATAAGCATAGGGGG-3’。
3.一种制备检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记的方法,其特征在于下列步骤:
1)以萝卜“武青一号”为母本,以萝卜“新洲花叶”为父本进行杂交得到杂种F1,将所得的F1植株套袋自交、回交,得到F2和BC1分离群体;
2)采用集体混合法构建萝卜叶浅裂DNA池和叶全裂DNA池;
3)将两亲本间有差异的引物对,对上述步骤2)构建的两个基因池进行PCR扩增,选择在两个基因池中表现有差异的引物组合EA1/MC8、EA3/MC4、EA4/MC4进一步对基因池间各单株的基因组DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定筛选出的引物组合EA1/MC8为叶缘裂刻性状的连锁标记,再对F2分离群体的DNA样品进行PCR扩增和电泳检测;
其中:
两亲本间有差异的引物对的DNA序列如下所示:
EA1:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA A-3’ MC8:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3’;
EA2:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA T-3’ MG7:5’-GAT GAG TCC TGA GTA AGT C-3’;
EA2:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA T-3’ MC6:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T-3’;
EA2:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA T-3’ MC7:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACTC-3’;
EA3:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA C-3’ MC3:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACA C-3’;
EA3:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA C-3’ MC2:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACA T-3’;
EA3:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA C-3’ MC4:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACA G-3’;
EA3:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA C-3’ MC6:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T-3’;
EA3:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA C-3’ MC12:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACC G-3’;
EA3:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA C-3’ MC14:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACG T-3’;
EA4:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA G-3’ MC1:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACA A-3’
EA4:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA G-3’ MC2:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACA T-3’;
EA4:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA G-3’ MC4:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACA G-3’;
EA4:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA G-3’ MC5:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACT A-3’;
EA4:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA G-3’ MC11:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACC C-3’;
EA4:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA G-3’ MC16:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACG G-3’;
EA5:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAT A-3’ MC6:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T-3’;
EA5:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAT A-3’ MC7:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACT C-3’;
EA5:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAT A-3’ MC8:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3’;
EA5:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAT A-3’ MG16:5’-GAT GAG TCC TGA GTA AGG G-3’;
EA6:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAT T-3’ MC14:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACG T-3’;
EA6:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAT T-3’ MC15:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACG C-3’;
EA6:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAT T-3’ MG8:5’-GAT GAG TCC TGA GTA AGT G-3’;
EA6:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAT T-3’ MG13:5’-GAT GAG TCC TGA GTA AGG T-3’;
EA7:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAT C-3’ MG13:5’-GAT GAG TCC TGA GTA AGG T-3’;
EA7:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAT C-3’ MG15:5’-GAT GAG TCC TGA GTA AGG C-3’;
EA8:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAT G-3’ MC7:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACT C-3’;
EA8:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAT G-3’ MG9:5’-GAT GAG TCC TGA GTA AGC A-3’;
EA11:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAC C-3’ MC6:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T-3’;
EA14:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAG T-3’ MG16:5’-GAT GAG TCC TGA GTA AGG G.-3’
4)将步骤3)筛选得到的与萝卜叶缘缺刻性状紧密连锁的AFLP标记引物组合EA1/MC8的片段进行回收、克隆、测序,所得的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示;
其中:EA1/MC8引物组合的序列如下:
EA1:5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA A-3’,
MC8:5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3’。
5)通过对步骤4)测序结果进行特异引物的设计,将筛选得到的与萝卜叶缘缺刻性状紧密连锁的AFLP标记转化为SCAR标记引物,该SCAR标记引物的DNA序列如下所示;
正向引物5’-ACTGGTTATCTTGTGGTGATGGAAAC-3’,
反向引物5’-AAGTCGGTTTGGATAAGCATAGGGGG-3’。
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