[发明专利]一种构建重组酵母生物合成葡萄糖醛酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种构建重组酵母生物合成葡萄糖醛酸的方法，属于代谢工程领域。

背景技术

葡萄糖醛酸，全称D-(+)-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)，是葡萄糖的伯醇羟基被氧化成羧基形成的化合物，其水溶液不稳定，易转化形成3,6-葡萄糖醛酸内酯，二者在水溶液中处于互变平衡状态。葡萄糖醛酸在加热且有强酸存在时，易发生脱羧而生成CO2、呋喃等产品。

葡萄糖醛酸广泛存在于动植物中，具有重要的生物学功能。它能结合含有羟基、氨基、羧基、巯基等基团的有毒物质，增强毒性物质水溶性，使之快速排出肾脏，起到解毒作用。同时，葡萄糖醛酸能与被结合物分子上活性基团-酚羟基结合，降低相关激素及药物的生物学作用。其衍生物葡萄糖醛酸内酯是也是一种保健药物，它有利于肝脏的解毒，可以预防治疗流行性肝炎、肝硬化、食物及药物中毒，同时还是功能性饮料、保健食品的添加剂。随着人们健康观念的日益增强和对生活质量要求的提高，对于葡萄糖醛酸的需求会越来越大。

目前，葡萄糖醛酸的生产方法主要有：化学氧化法、多糖水解法和生物发酵法。

化学氧化法主要是采用无机氧化或者是催化氧化，目前我国工业生产葡萄糖醛酸及其内酯的主要方法为无机氧化法。无机氧化法选择性差、氧化程度不能有效控制、产物分离回收困难，对环境污染严重。催化氧化主要分为均相催化氧化和非均相催化氧化。

多糖水解法是通过酸或碱水解自然界中存在的多糖醛酸或含糖醛酸的多糖，提取分离获得醛酸。但是由于葡萄糖醛酸间的糖苷键非常稳定，需要强烈的反应条件，如加强酸或强碱，但此种条件下，会对葡萄糖醛酸产生破坏，回收率低。

生物发酵法是利用特定的菌株或生物酶对能形成葡萄糖醛酸或其前体的特定物质进行发酵来制备葡萄糖醛酸。目前对于生物发酵法生产葡萄糖醛酸的研究相对较少，但是生物发酵法具有成本低、环境污染小、特异性高等优点，利用特定的微生物菌株来发酵生产葡萄糖醛酸具有较大的发展前景。

目前葡萄糖醛酸的生产主要是以淀粉为原料，经硝酸氧化，加压水解来生产，这种方法存在这诸多弊端，如环境污染严重、回收困难、选择性差等问题。为了解决上述问题，通过基因工程技术改造微生物细胞的代谢，以改善细胞的性能来发酵生产目的产物，具有广阔的发展前景。

酵母是单细胞低等真核生物，既有原核生物细胞容易培养、生长速度快、操作简单，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能。由于它培养时营养要求低、生长快、培养基廉价、可进行高密度发酵培养，因此是一种可用于生产目标生物产品的优良宿主。

目前尚未发现有通过重组酵母来发酵生产葡萄糖醛酸的报道，原始的酵母菌株并不能生成葡萄糖醛酸，鉴于此，本发明中构建的新型重组工程菌，在微生物发酵生产葡萄糖醛酸方面，提供了新的方法与思路

发明内容

本发明通过在酵母重组菌中表达不同来源的肌醇加氧酶基因(MIOX)，以葡萄糖或肌醇为底物，实现葡萄糖醛酸的生物合成。

本发明提供一种重组酵母菌，是将肌醇加氧酶基因MIOX克隆至出发酵母宿主菌中构建的重组酵母菌。

所述肌醇加氧酶基因MIOX来源于以下任意一种：小鼠(mouse)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、白假丝酵母(Candida albicans)。

所述肌醇加氧酶基因MIOX，在本发明的一种实施方式中是来源于毕赤酵母。

所述肌醇加氧酶基因MIOX，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

所述肌醇加氧酶基因MIOX，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述出发酵母宿主菌是以下任意一种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、毕赤酵母(Pichia pastoris)。

所述出发酵母宿主菌，在本发明的一种实施方式是毕赤酵母。

所述重组酵母菌中，调控表达肌醇加氧酶基因的启动子为GAP、Gal1、AOX1或者TEF1。

本发明还提供一种所述重组酵母菌的构建方法，是将肌醇加氧酶基因MIOX克隆到表达载体上形成重组载体，再将重组载体线性化后转入酵母宿主菌中，得到重组酵母菌。

所述表达载体是以下任意一种：pGAPZA、pGAPZB、pGAPZC、pPICZA、pPICZB、pPICZC及pPIC9K。