[发明专利]固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法

权利要求书

1.一种固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1、将2-氯-3-苯甲基氯树脂、三苯甲基醇树脂或4-羟甲基-3-甲氧基丁酸树脂置于二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮中10～120min，充分溶胀，所得溶胀树脂溶液中树脂的浓度为0.05～0.2g/ml；

步骤2、向步骤1所得溶胀树脂溶液中加入9-芴甲氧羰基保护的氨基酸与二异丙基乙基胺或9-芴甲氧羰基保护的氨基酸与缩合剂，于10～45℃反应15～60min；抽干，加入封闭试剂反应15～30min以封闭未反应的基团，以N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤树脂数次，加入脱除试剂脱除9-芴甲氧羰基保护基保护的氨基酸上的9-芴甲氧羰基保护基，洗涤后加入接肽试剂进行接肽反应，得肽树脂链，即氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂如下序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5；

步骤3、将步骤2所得肽树脂链加入到稀酸或弱酸溶液中，于10～45℃反应60～90min，加入2,4,6-三甲基吡啶或二异丙基乙基胺中和，过滤；滤液浓缩，加入醇类、醚类或烷类析出溶剂析出保护肽固体，过滤收集滤饼真空干燥得到肽段，即氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的如下序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5；

步骤4、将4-(4’-二甲氧基-9-芴甲氧胺甲基)-苯氧甲基树脂置于二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮中30～60min，充分溶胀，溶胀树脂溶液中树脂的重量体积浓度为0.05～0.2g/ml；

步骤5、在步骤4所得溶胀树脂溶液中加入脱除试剂，于10～45℃反应15～30min，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤数次，加入9-芴甲氧羰基保护的的氨基酸、缩合剂、二异丙基乙基胺的接肽试剂全溶物连接第一个氨基酸到树脂上，于10～45℃反应0.5～3.0h，抽干，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤树脂数次，加入脱除试剂进行脱除反应脱除Fmoc保护基，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤后，加入9-芴甲氧羰基保护基保护的氨基酸、缩合剂、二异丙基乙基胺的接肽试剂进行接肽反应得到肽树脂，即氨基端经9-芴甲氧羰基修饰、羧基端连接树脂的SEQ ID No:2；

步骤6、将肽树脂用溶胀剂充分溶胀后，加入脱除试剂脱除9-芴甲氧羰基，于10～45℃反应15～30min，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤数次,再依次加入氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:3、缩合剂、二异丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮全溶物；氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:4、缩合剂、二异丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮全溶物；氨基端经9-芴甲氧羰基修饰的SEQ ID No:5、缩合剂、二异丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮全溶物；于10～45℃反应0.5～3.0h，抽干，每加入一个肽段都要用N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗涤树脂数次，加入脱除试剂脱除保护基，得如下全保护肽树脂，即羧基末端连接树脂的依次包括SEQ ID No:5、SEQ ID No:4、SEQ ID No:3和SEQ ID No:2的序列；

步骤7、向步骤6所得全保护肽树脂中加入T辅助细胞表位、缩合剂的全溶物，于10～45℃反应0.5～6.0h，抽干，依次以二氯甲烷、N-甲基-2-吡咯烷酮、甲醇洗涤树脂数次得到全保护的抗原肽2700树脂，即氨基端经T辅助细胞表位修饰、羧基末端连接树脂的依次包括SEQ ID No:5、SEQ ID No:4、SEQ ID No:3和SEQ ID No:2的序列；

步骤8、将预冷的-10～10℃的切断液加入到步骤7的抗原肽2700树脂中切除所有保护基团及树脂载体，于10～45℃反应1～4h，过滤，浓缩滤液后加入甲基叔丁基醚析出沉淀，用甲基叔丁基醚洗涤沉淀数次后干燥得到未环化的抗原肽2700粗品，即氨基端经T辅助细胞表位修饰的SEQ ID No:1；

步骤9、将步骤8所得抗原肽2700粗品溶于二甲亚砜溶液，调节pH值至6.0～8.0的条件下进行完全环化，即得环化合成肽抗原2700。