[发明专利]用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX‑6His‑CTBt‑Bt

说明书

技术领域

本发明涉及抗病毒疫苗研发领域，尤其是涉及一种用于生产丙型肝炎（丙肝）病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt。

背景技术

丙型肝炎病毒是丙型肝炎的致病因子，该病毒感染的世界总人数超过1.7亿，我国感染人数超过4000万。大多数丙型肝炎病毒感染者为持续性感染，进而引起慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。据报道，全球40%的慢性肝病和80%的肝细胞癌与丙型肝炎病毒有关，每年全球用于丙肝治疗费用超过1000亿美元。现有的治疗药物只对部分丙型肝炎肝病毒感染者有效，且治疗时间长，成本高和有副作用。疫苗是防治，特别是预防病毒性疾病的一种极其经济、简单和有效的手段。但是，至今还没有疫苗来预防和治疗丙型肝炎病毒感染。因此，研发具有自主知识产权的丙型肝炎病毒（特别是难治性丙型肝炎病毒）基因工程多表位疫苗具有极其重要的科学价值、无可估量的商业价值和社会效益。

植物作为制备基因工程疫苗生物反应器具有生产成本低、安全性好、可口服、容易运输和保存等优点，因而成为近年来国际上疫苗研究和生产的一个热点和发展趋势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于生产丙型肝炎病毒多表位疫苗的表达载体PVX-6His-CTBt-Bt。

本发明的目的是这样实现的：

（1）疫苗氨基酸组成设计：

丙型肝炎肝病毒多表位疫苗氨基酸组成设计：从N端至C端依次为6个组氨酸（便于疫苗纯化），口服免疫佐剂霍乱毒素B亚单位CTB（增强疫苗口服免疫效果），难治性丙型肝炎病毒基因型1的6个B细胞中和抗原表位Bt（E1_313-327aa-E2_396-424aa-E2_438-447aa-E2_523-540aa-E2_610-627aa-E2_631-648aa）。各个抗原表位之间通过一个甘氨酸和一个丝氨酸残基隔开）。

（2）疫苗密码子优化：

为了促进疫苗基因在烟草的高表达，利用偏爱密码子在线分析软件http://www.bioinformatics.org/codon/cgi-bin/codon.cgi分析，合成6His-CTBt-Bt疫苗所需的优化密码子序列。

（3）疫苗基因合成

为了便于6His-CTBt-Bt疫苗基因的克隆和表达，对上述优化的丙型肝炎病毒多表位疫苗6His-CTBt-Bt密码子序列，在其5’端引入ClaI酶切位点和烟草偏爱Kozak序列，3’端引入终止密码子和SalI酶切位点。使用在线分析软件http://helixweb.nih.gov/dnaworks/ 设计22条引物，PCR合成疫苗基因6His-CTBt-Bt。

（4）疫苗表达载体构建及鉴定测序：

PCR合成的6His-CTBt-Bt疫苗基因和马铃薯X病毒载体PVX201，使用ClaI和SalI双酶切，连接，获得疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，对表达载体进行酶切和测序鉴定。

（5）疫苗在烟草的表达和Western blot鉴定：

金刚砂磨损烟叶叶片，在磨损处接种疫苗表达载体PVX-6His-CTBt-Bt，同时以马铃薯X病毒PVX201（阴性对照）和PVX204（携带GFP基因接种烟叶作为对照，每个叶片接种病毒载体量为2-4μg。通过观察GFP蛋白表达验证、优化病毒接种和复制效果,制备烟草的蛋白提取物，分别使用鼠源的6×His Tag抗体（LanPower™）和CTB抗体（antibodies-online Inc），Western blot检测疫苗表达。Ni柱纯化表达的疫苗蛋白6His-CTBt-Bt。

（6）动物实验测定疫苗的免疫特性和安全性：