[发明专利]一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件

说明书

技术领域

本发明是涉及的是一种基于纳米对电极的单分子核酸测序器件，是一种单分子核酸测序器件，通过检测核酸聚合酶的导电特性实现单分子核酸分子的快速测序，该发明属于第三代DNA测序器件。

背景技术

DNA测序技术是近代生命科学发展的重要里程碑之一。近十年来，低成本、高通量DNA测序技术的出现，引起了生命这一高度复杂系统中最为庞大、最为核心的核酸序列信息爆发性地增长，使生命科学和医学面临前所未有的机遇和挑战。生命遗传密码的彻底破译即将成为可能，遗传信息大数据的普及将正在惠及到人类社会每一个普通成员的生存和健康。

目前大量使用的新一代DNA测序技术是所谓的第二代测序技术。该测序技术通过对被测目标核酸进行平行扩增，构建测序文库，克隆出上百万种固相化单链核酸片段模板，进行高通量并行序列测定。第二代测序技术存在下列不足：（１）DNA测序文库制备需要较大量的起始DNA样本；（２）样本的平行扩增还可能导致测序文库制备的偏性；（３）制备测序文库需要大量的分子生物学操作，文库制备时间较长，成本高；（４）通过DNA生物合成反应在DNA测序模板上进行逐个碱基阅读，一次生化反应仅能阅读一个碱基，这也导致了测序速度和通量提升的瓶颈，因此虽然第二代测序技术比第一代的桑格测序技术在测序通量方面取得了巨大成功，在不到十年时间内使人类个体基因组的测序成本下降了近万倍，但是与未来应用于实际的需求相比，第二代测序技术仍然是一项昂贵的技术，不利于推广应用，同时它还存在测序结果报告周期长，测序的准确性还不高，读长较短以及测序偏性等问题。

第三代测序技术是目前国际学术界和产业界追捧的对象。第三代测序技术有如下三个特点：（1）实现单分子DNA测序。无需对测序对象进行扩增和放大，能够克服由基因扩增引起的测序偏向性；（2）实现连续测序。也就是DNA链上碱基的阅读是不间断的，这一特性不仅能够大幅度提高测序速度，也会使DNA的读长大幅度增加；（3）更低的测序成本。因为三代测序技术在测序反应中无需不断加入生化试剂，在DNA测序过程中没有试剂成本。由上述三个特征可以看出，第三代测序技术的实现将会是生命科学和医学发展史上的又一重要里程碑，人们可以随时随地、实时、低成本地获取人体、环境的各种各样的核酸信息，随时掌控生命体中遗传与变异、表达与调控、感染和防卫等事件，真正促进实现4P和精准的医疗。

到目前为止，第三代测序技术的原理可以分为三类。

（1）成像测序法

通过高分辨率成像技术进行核酸序列的鉴定，是最早报导的单分子DNA测序技术。早在1977年Cole等通过锇等配位化合物与核酸上的碱基进行特异性结合，电子显微镜上观察到Os点阵，获得了单链DNA的影像。近二十多年来，有许多关于用扫描探针显微镜对核酸分子进行显微成像和碱基识别的报导，不过其识别的准确性和速度还远远达不到DNA测序的要求。

（2）合成测序法

本世纪初，美国加州理工发表了单分子合成测序的结果。在玻片上构建单分子DNA测序文库，采用与可切除封闭基团的荧光标记碱基进行测序，但是该方法测序通量低、读长短、错误率高，产品成熟度差，并没有形成销售。PicBio等公司通过在核苷酸的磷酸基团上修饰荧光基团，在合成测序时能够自动切除的荧光基团，实现了单分子DNA上碱基的连续阅读。为了提高单分子荧光检测的灵敏度，其芯片采用Z波导腔。该技术能够自动快速并行地实现单分子ＤＮＡ的测序，其测序速度快，读长较长，但测序成本高、通量低，准确性较差。

（3）纳米孔测序法

纳米孔测序方法是单链DNA分子在电场驱动下穿过纳米尺度的微孔，通过实时检测过孔电导的变化，识别过孔DNA单链上的碱基。制备纳米孔的材料可以采用天然的或经过改造过的蛋白质分子（如α溶血素、Mps蛋白），也可以是用微加工制备的固态纳米孔（如氮化硅、石墨烯）。生物纳米孔能够识别单个碱基，但对在单链DNA分子上碱基的准确识别还存在技术瓶颈。固态纳米孔由于孔径的可控性和稳定性、单链过孔速度、纳米孔长度等因素，尚未达DNA链单个碱基的识别能力。一些公司通过在纳米孔上构建场效应器件、引入可检测横向隧道电流的对电极、组装具有分子识别功能的分子基团、增加荧光标记分子等方法，试图提高对单碱基识别能力。