[发明专利]一种博伊丁假丝酵母及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物及其应用技术领域，具体涉及一种博伊丁假丝酵母，以及该博伊丁假丝酵母在催化合成阿托伐他汀中间体中的应用。

背景技术

阿托伐他汀是立普妥的活性成分，具有抑制低密度胆固醇(所谓的“坏胆固醇”)的产生、降低血液中低密度胆固醇含量的作用，在临床上对动脉粥样硬化、冠心病、高脂血症和高胆固醇血症等心血管疾病的预防和治疗都具有重要意义，已成为世界上目前最畅销的调血脂类心血管疾病药物。

6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(简称ATS-7)是合成阿托伐他汀钙的关键手性中间体，传统的ATS-7化学合成法不仅使用硼烷类试剂和正丁基锂等昂贵的催化剂和有毒有害试剂，而且要在低于-60℃的条件下进行反应，再加上反应立体选择性低、副反应多，使得传统的ATS-7化学合成收率低、难度大，因此生产效率低、成本高。

生物催化不对称合成方法是要解决ATS-7生产问题的主要方法。生物催化不对称合成即利用提纯后的商品酶或微生物中的酶进行不对称还原，其中酶催化的不对称还原反应需要添加昂贵的辅酶；微生物催化的不对称还原反应是通过微生物全细胞中酶的立体选择性来实现，同时辅酶的循环由细胞自动完成，进行不对称还原反应时只需加入少量廉价的碳源(葡萄糖或者乙醇)作为辅助底物即可。生物催化因立体选择性强、获得产物的纯度较高、成本低廉、反应条件温和、操作安全、对环境的压力较小，在合成手性化合物中具有非常大的优势。但是筛选到具有高立体选择性的优良微生物菌株比较困难。

Codexis公司发现酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)羰基还原酶能够不对称还原(5R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-双羟基己酸叔丁酯(美国，公告号：US 0195465 A1，公告日2011年8月11日)。浙江工业大学发现，卡里比克毕赤酵母(Pichia caribbic ZJB-09225)能够细胞催化(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，产物对映体过量值达99.5％以上(具有差向选择性还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株筛选和鉴定)。他们还发现，季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii X25)静息细胞可以不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。最佳催化条件为35℃、pH值7.0，在低底物转化率时，能够制备光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(具有非对映选择性还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株筛选与鉴定)。

由于野生型微生物细胞含有多种醛/羰基还原酶，利用一些野生型微生物进行转化时很难获得单一光学纯的转化产物，因此限制了其在生产上的应用。目前已经有很多人通过构建工程菌来获得较高对映体过量值的产物。国外研究利用酿酒酵母(S.cerevisiae)的羰基还原酶基因ydl(Genbank ID：NP010159)构建了大肠杆菌基因工程菌，进行AST-7的生物制备研究，产物d.e.值大于99％(美国，公告号：WO 2008/042876 A2，公告日2008年4月10日)。国内研究人员分别利用季也蒙毕赤酵母(P.guilliermondii)的羰基还原酶基因cr3和葡萄糖脱氢酶基因gdh4成功构建了两种基因的工程菌，然后同时用两种菌进行AST-7的转化研究，转化率100％，产物d.e.值大于99.5％(羰基还原酶不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯)。研究者又利用羰基还原酶基因cr3和葡萄糖脱氢酶基因gdh4同时转入大肠杆菌中，构建了共表达菌株进行AST-7的制备研究，底物转化率可达99.0％，产物d.e.值大于99.5％(生物催化法合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯)。国内公司利用含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌制备重组酮还原酶，用于AST-7的制备研究，初步简化了生物转化工艺(中国，公告号：CN 102978249A，公告日2013年3月20日)。然而，使用表达外源蛋白的工程菌进行生物催化存在菌体的稳定性差、反应转化率有时不理想等问题，同时存在食品安全方面的隐患。

发明内容