[发明专利]一种快速筛选叶酸高产菌的方法

权利要求书

1.一种快速筛选叶酸高产菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将酵母菌Y2.12 在22～32 °C下培养24小时进行活化，然后置于4 °C下保藏2～15 d，获得活化的酵母菌Y2.12的斜面保藏菌，通过控制菌种的斜面保藏时间，可以抑制菌体的生命活动，但不能使菌体进入休眠状态；

（2）取上述斜面保藏菌接种于种子培养基中，在22～32 °C下摇瓶培养24～48 h，获得种子培养物；

（3）将酵母菌液涂布于无菌平皿上，风干，进行N⁺或Ar⁺离子注入，洗脱后移至摇瓶种子培养基上22～32 °C培养2～4 d；

（4）种液冰浴4～10 min，3000～8000 rpm离心4～10 min，沉淀采用不同方法制备得到感受态细胞，离心；

（5）菌体经不同缓冲液制成悬液，加入0.5～15 μg/mL Rh123染料，暗处孵化5～60 min离心，去除多余的荧光染料，得到的沉淀菌体再经无菌去离子水清洗两次后制成一定浓度均匀悬液；

（6）将染色好的样品放入流式细胞仪，通过530/40 nm带通滤片（FL1）检测荧光强度信号，以FL1-H表示，检测1×10⁴个细胞，前向散射=E00，侧向散射=400～500, 激发波长=400～500 nm，发射波长=500～600 nm，得到流式细胞仪检测FCM图谱；

（7）根据FCM图谱显示结果，用装有无菌发酵培养基的流式管接取不同荧光强度区域的菌体，分别在20～30 °C培养2～3 d后转接10 μL至甘油管中保藏，其余10 mL移至发酵培养基培养6 d后用HPLC检测产量，用于验证FCM检测结果的准确性。

2.根据权利要求1所述的快速筛选叶酸高产菌的方法，其特征在于：步骤（1）所述的斜面培养基配方为葡萄糖0.5～3.5 g/L、氯化钾0.5～4.0 g/L、酵母浸膏1.0～5.5 g/L、醋酸钠2.6～10.2 g/L、琼脂15～20 g/L，pH3～6。

3.根据权利要求1所述的快速筛选叶酸高产菌的方法，其特征在于：步骤（2）、（3）所述的种子培养基配方为葡萄糖20～41 g/L、酵母浸膏1.1～3.5 g/L、硫酸铵1.0～3.2 g/L、无水硫酸镁1.2～2.5 g/L、磷酸氢二钾0.7～4.5 g/L、玉米浆4.2～13.1 g/L，pH自然。

4.根据权利要求1所述的快速筛选叶酸高产菌的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，将活化好的菌种用无菌生理盐水稀释至菌液中菌体浓度为每毫升含10⁷个细胞，然后用微量移液器取该菌悬液均匀涂布于无菌平皿上。

5.根据权利要求1所述的快速筛选叶酸高产菌的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的N⁺或Ar⁺离子注入能量为10～60 kev，剂量为1.3×10¹⁵～3.9×10¹⁵ N⁺/cm²。

6.根据权利要求1所述的快速筛选叶酸高产菌的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，感受态细胞制备分别采用热击、添加聚氧乙烯油醚、异丙醇、二甲基亚砜、蔗糖中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的快速筛选叶酸高产菌的方法，其特征在于：所述步骤（5）中的缓冲液为去离子水、生理盐水以及MgCl₂溶液中的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的快速筛选叶酸高产菌的方法，其特征在于：所述步骤（7）的发酵培养基配方为葡萄糖23～52 g/L、酵母浸膏1.0～3.2 g/L、玉米浆1.2～11.1 g/L、硫酸铵1.0～3.2 g/L、无水硫酸镁1.2～2.5 g/L、磷酸氢二钾0.7～4.5 g/L，pH 4～6。