[发明专利]一种甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及发酵培养过程中甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法。

背景技术

甲醇营养型酵母(酿酒酵母、汉逊酵母)表达系统常用于蛋白药物及疫苗的研发和生产，其表达载体为整合型质粒，即含有外源基因的质粒可整合至酵母基因组中，在甲醇诱导启动子(pMOX)的作用下，外源基因得以表达。甲醇营养型酵母一般先在以甘油为碳源的培养基中生长，培养至较高浓度时，添加纯甲醇继续诱导生长，在此后续过程中，甲醇既作为碳源也作为诱导剂，促进目的蛋白的表达。该方法可大大提高表达产量，外源蛋白的表达量可达到克级。然而，在传统诱导工艺中，只是单纯的加入甲醇进行后期的培养和诱导，由于酵母长期(培养周期约为7天)的高密度培养，容易导致后期营养成分降低，营养成分缺乏制约了酵母的生长，导致收获菌体密度低，影响了目的蛋白的产量。因此，有必要提供一种新的蛋白诱导方法，提高菌体生长密度，增加目的蛋白产量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种新的能够提高菌体生长密度和蛋白产量的甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法。

为了达到这一目的，本发明提供了一种甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法，该方法包括：首先进行酵母前培养，至发酵液中菌体的OD₆₀₀达到80-150时，添加混合诱导剂进行诱导培养；

其中，以体积份计，所述混合诱导剂的组成成分包括：甲醇5-9份，酵母发酵培养基1-5份。

可选的，相对于每升发酵液，所述混合诱导剂的添加剂量为每小时添加一次，每次添加1-5mL。

可选的，所述诱导培养的条件包括：温度为29-39℃、溶解氧浓度为5-50％、时间为60-100h。

可选的，所述方法包括在OD₆₀₀达到160-250时停止诱导培养，收获发酵产物。

可选的，所述方法还包括诱导培养前的酵母前培养，所述酵母前培养包括以下步骤：

1)按照1％-15％的接种比例，将酵母种子接种至一级培养基中，在29℃-39℃下摇瓶震荡培养至OD₆₀₀至5-20之间，获得一级培养液；

2)将一级培养液按照1％-15％的接种比例，转接至二级培养基中，29℃-39℃摇瓶震荡培养至OD₆₀₀至5-20之间，获得二级培养液；

3)将二级培养液按照1％-15％的接种比例，转接至含有发酵培养基的发酵罐中发酵培养，发酵过程中根据溶氧的变化添加甘油，控制含氧量不低于20％，在29℃-39℃下培养，获得OD₆₀₀为80-150的发酵液。

可选的，所述酵母为酿酒酵母、汉逊酵母或毕赤酵母。

可选的，按重量份计，所述酵母发酵培养基的组成成分包括：甘油8-11份，磷酸二氢钾4.5-5.5份，磷酸二氢铵9-11份，硫酸镁4.8-4.2份，氯化钾2.1-2.5份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸亚铵0.08-0.12份。

本发明所提供诱导的方法，能够促进酵母的生长，使得收获菌体密度升高，在原有基础上大大提高目的蛋白的产量。菌液密度和蛋白收获量均较传统工艺提高了10％以上；而且蛋白的活性与原有纯化工艺得到的蛋白无异，免疫原性较高。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

根据本发明的一种甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法，所述方法包括：首先进行酵母前培养，至发酵液中菌体的OD₆₀₀达到80-150时，添加混合诱导剂进行诱导培养；

其中所述甲醇营养型酵母指代一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源生产蛋白药物、疫苗等蛋白制品的酵母菌，在本发明所提供的方法中，所述甲醇营养型酵母的种类包括但不限于：酿酒酵母、汉逊酵母和毕赤酵母。

其中，以体积份计，所述混合诱导剂的组成成分包括：甲醇5-9份，酵母发酵培养基1-5份。

在本发明所提供的方法中，所述酵母发酵培养基为本领域进行酵母发酵培养时发酵培养阶段所使用的培养基。具体的培养基种类根据培养菌株和生产的蛋白种类进行调整。

在本发明的一种实施方式中，按重量份计，所述酵母发酵培养基的组成成分包括：甘油8-11份，磷酸二氢钾4.5-5.5份，磷酸二氢铵9-11份，硫酸镁4.8-4.2份，氯化钾2.1-2.5份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸亚铵0.08-0.12份。