[发明专利]一种快速检测花生过敏原Arah2的胶体金试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种花生过敏原成分Ara h 2的免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法，且可以通过对Ara h 2的监测实现对花生过敏原的快速诊断，属于免疫检测技术领域。

背景技术

花生过敏是食物过敏中导致死亡人数最高的一种。因食物过敏引发的死亡90%都是由花生导致的。花生过敏反应因其潜在的危险性、长期性以及不断增加的发病率而日益受到重视。

花生过敏原包括多种蛋白质成分，其中Ara h 2是一种分子质量为17kDa~20kDa的同种异型蛋白，约占花生蛋白总量的10%。Ara h 2被认为是主要的过敏原成分，90%以上的花生过敏患者对其过敏。因此，可通过对Ara h 2的监测实现对花生过敏原的快速诊断。

目前，对过敏原的定量检测方法很多，如双免疫扩散试验、放射免疫法和高效液相法、聚合酶链式反应（PCR）分析法、组胺释放实验（HRT）、过敏原指纹图谱快速检测方法等。但都存在各自不同的问题，如检测速度慢、成本高、需要特定的分析仪器等。而免疫层析胶体金试纸条具有操作简单快速、处理样品量大、灵敏度高且廉价等优点，而且不需要借助专门仪器，适合现场快速检测，因此对于大量样品的现场检测具有重要的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速检测花生过敏原Ara h 2的胶体金试纸条，操作简单，快速方便，灵敏度高，稳定性好，成本低廉，用于食品中花生过敏原的快速大量检测。

本发明另一个目的在于提供一种免疫胶体金试纸条的制备方法，包括抗Ara h 2特异性抗体的制备，Ara h 2双抗体检测的配对筛选，Ara h 2免疫胶体金检测试纸条的制备。该试纸条操作简便、快速、准确，检测全过程只需5min，不受环境条件的干扰，特异性好，检测灵敏度高，最低检测限为1ng/mL。

本发明适用于医院，企业及普通家庭等，可实现食品或临床样本中花生过敏原Ara h 2的快速检测。

本发明的技术方案：一种快速检测花生过敏原Ara h 2的胶体金试纸条，包括PVC底板，在PVC底板两端分别设有样品垫和吸水垫；PVC底板中部设置有硝酸纤维素膜检测层，在硝酸纤维素膜检测层与样品垫之间设置有胶体金结合垫；所述胶体金结合垫一端与样品垫相连接叠放，另一端叠放于硝酸纤维素膜检测层上。

所述硝酸纤维素膜检测层上依次设置有检测线和质控线。所述胶体金结合垫包被有金标标记抗Ara h 2抗体Ara h 2-mAb-5（CGMCC No.9314），所述检测线上包被有抗Ara h 2抗体Ara h 2-mAb-1（CGMCC No.9315）。所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。

所述花生过敏原Ara h 2的胶体金快速检测试纸条的制备方法，步骤为：

（1）提取花生过敏原粗蛋白：

将新鲜花生仁去皮，经高速粉碎机处理得到粉末状，称取10g，按1:10（W/V）浸入石油醚（60~90℃）中脱脂，4 ℃磁力搅拌下浸提4h，8000 r/mim离心10 min，弃上清，沉淀反复浸提三次后置于通风橱使石油醚挥发得脱脂花生。随即按1:10（W/V）浸入0.01 M pH7.4 PBS中在4 ℃下浸提过夜， 8000 r/min离心10 min，弃去沉淀，上清即为花生粗蛋白浸提液。

（2）提取纯化Ara h 2：

在花生粗蛋白浸提液中缓慢加入饱和硫酸铵固体，边加边搅拌，加入的完全溶解后才继续往后加，直至饱和度为40%，4 ℃静置1 h，8000 r/min 离心20 min，收集沉淀复溶于0.01 M pH7.4 PBS中，得40%饱和度组分。上清中继续加入饱和硫酸铵固体直至饱和度为60%，按上述40%饱和度组分获得方法得到60%饱和度组分。同样继续往上清中加入硫酸铵得到80%饱和度组分。上述三个分级组分别在0.01 M pH7.4 PBS中透析24 h后用SDS-PAGE鉴定，Ara h 2含量最高的组分再进行凝胶过滤层析分离。对洗脱峰进行SDS-PAGE鉴定，Ara h 2含量最高的洗脱峰将用于下一步实验。

（3）抗Ara h 2特异性单克隆抗体的制备：

将步骤(2)中提取纯化的Ara h 2作为免疫原免疫BALB/c小鼠，多次免疫后用直接ELISA法挑选亲和性最高的小鼠进行融合，通过筛选得到6个对Ara h 2具有强亲和性的细胞株。

（4）抗Ara h2特异性单克隆抗体的配对筛选：