[发明专利]一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法。

背景技术

物种的快速鉴定和识别是保护生物学和生物多样性研究的基础。然而，长期以来，人们对于植物物种的鉴定和识别主要依赖于物种间明显的外部形态特征，如植物的花、果实、种子、根、茎和叶等。同时，还依赖于专业分类人员的实践经验和指导。然而，在当前传统分类学专业人员急剧减少的情况下，基于物种外部形态特征的分类学鉴定方法，很难准确鉴定和识别物种间外部形态特征差异较小(尤其是物种间存在中间过渡形态性状的时候)的近缘植物物种类群。

近年来，随着分子生物学技术的发展，尤其是DNA分子测序技术的飞速进步，DNA分子条形码(DNA Barcoding)技术被提出用来快速鉴定物种。这一方法主要是通过对一段标准目的DNA分子序列片段进行比对分析从而对相关物种进行快速鉴定。作为一种新型的物种鉴定手段，DNA条形码技术自提出以来就被广泛应用到很多近缘类群的物种鉴定方面，如哺乳动物、鸟类、昆虫和鱼类等。在这些动物类群中，线粒体细胞色素C氧化酶(COI)基因序列有着丰富的和物种特有的变异位点，被认为可以作为动物物种鉴别的核心DNA分子条形码标记。然而，在植物类群中，由于线粒体基因较慢的进化速率，导致很难寻找到含有丰富变异的线粒体基因位点，这严重限制了线粒体基因标记在植物类群物种鉴定中的应用。鉴于此，国际生命条形码联盟(CBOL)和中国植物条形码研究团队(China Plant BOL Group)通过对大量植物类群的多个叶绿体DNA片段的反复筛选和实验研究，发现在被子植物中进化速率相对较快的叶绿体rbcL+matK基因标记组合以及核ITS基因片段有着丰富的变异位点，可以用来作为种子植物的核心DNA条形码分子标记。另外，叶绿体trnH-psbA基因片段可以作为辅助条形码标记，用于植物物种的DNA分子鉴定。

然而，对于裸子植物类群来说，由于叶绿体基因较慢的突变速率，加上裸子植物本身较长的世代周期(从种子发育到植株个体成熟到再次产生种子，大约需要15年左右的时间)和大的有效种群大小(数量)导致了叶绿体DNA条形码rbcL+matK+trnH-psbA标记组合以及核ITS基因片段无法准确区分裸子植物近缘物种。这尤其表现在近期发生物种形成历史的柏科刺柏属物种上面，导致刺柏属物种间叶绿体DNA片段以及核ITS基因片段基因位点间的大量共享，使得使用这些标准DNA条形码分子标记组合很难准确鉴定和识别刺柏属近缘物种。本发明拟找到一段能够在刺柏属物种中具有丰富变异位点的核基因引物进行区分和鉴定刺柏属近缘物种。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，柏科刺柏属物种由于具有大量相同的外部形态特征和一些中间过度形态，一般都为常绿乔木或灌木树种；雌雄同株或异株；叶为刺叶或鳞叶，披针形或近条形；雄球花卵圆形或矩圆形，雌球花近圆球形；球果浆果状，近球形；种鳞合生，肉质；种子1-6粒，无翅，常有树脂槽，这导致了运用传统的形态分类学鉴定方法很难快速准确的鉴别这些物种，同时，由于刺柏属物种之间相对较近的物种形成和分化历史和大的有效种群数量，使得利用单亲遗传、进化速率较慢的叶绿体DNA分子标记很难鉴别这些物种。研究发现，柏科刺柏属物种在国际生命条形码联盟和中国植物条形码研究团队推荐使用的核心叶绿体DNArbcL+matK+trnH-psbA条形码标记组合和核ITS基因片段上均存在大量的基因多态性共享，导致无法准确区分刺柏属近缘物种。另外，以前的物种分子鉴定研究，大多一个物种取样一个个体进行鉴定，导致一个物种在不同地方进行取样时，由于近缘物种间的基因多态性共享或渐渗，可能使得亲缘关系较近的物种具有相同的基因序列或变异，这给物种的准确鉴别带来了极大困难，因此，本发明的目的是筛选出一种能够在刺柏属多个近缘物种中取样多个个体，利用具有双亲遗传特征、而且进化速率较快的核基因DNA分子条形码标记，进行物种的快速和准确鉴别的方法；利用具有双亲遗传特征、而且进化速率较快的核基因DNA分子条形码标记，进行物种的快速和准确鉴别。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，能够对刺柏属近缘物种进行快速和准确鉴别的DNA分子条形码标记，主要是利用一段双亲遗传的核基因Chi1引物对刺柏属近缘种不同个体的DNA样品进行扩增和序列测定，从而进行序列比对分析以及系统进化树的构建，进一步比较分析序列间的变异以及系统进化树上不同物种个体的聚类情况来进行物种的快速鉴定；具体包括以下步骤：