[发明专利]一种百合脱毒籽球的快速培养方法

说明书

技术领域

本发明公开了切花百合脱毒培养的组培方法和利用鼓泡式生物反应器快速膨大脱毒小鳞茎(种球)的培养方法，属于植物组培快繁技术领域和植物细胞工程的技术领域。

背景技术

百合是重要的观赏花卉，主要用于切花品种生产。百合在开放条件下生长，不可避免地被病毒侵染，百合无症病毒Lilysymptomlessvirus(LSV)、黄瓜花叶病毒Cucumbermosaicvirus(CMV)、百合斑驳病毒Lilymottlevirus(LMoV)、郁金香碎花病毒Tulipbreakingvirus(TBV)和百合丛簇病毒Lilyrosettlevirus(LRV)是影响百合花卉生产的常见病毒。病毒侵染植株会造成百合农艺性状严重退化，极大地影响了百合的生产。寄生在百合鳞茎中的病毒，随着鳞茎芽眼萌发长成植株的生长过程，病毒会在百合植株体内进行复制繁殖，但在代谢活跃的茎尖分生组织中没有病毒。百合脱毒技术就是利用茎尖部分没有病毒的特性，在无菌环境条件下，利用人工配置的培养基，培育出无病毒试管苗或籽球，然后将组培苗和籽球在人工隔离或天然隔离条件下，生长成为供切花使用的商品种球。近年来国内百合的消费量逐年增大，但目前我国百合生产中，将近90%以上的种球依赖进口。少量的国产脱毒种球的生产，绝大多数采用传统组培方式，不但生产周期长，而且还需要投入大量的人力，频繁的更换培养基，生产过程需要很大的培养空间，为了保证培养空间温湿度，满足培养条件需要消耗很多能源。为了解决国产脱毒种球生产中存在的问题，特开展利用生物反应器快速培养百合脱毒籽球方法的研究。

发明内容

本发明包括:外植体灭菌和生长点的剥取；脱毒培养；组培各阶段培养基的配比；脱毒籽球在反应器中的膨大培养；冷藏春化；驯化移栽几个过程。本发明选用花卉市场大众喜爱的“西伯利亚”(Siberia),“索帮”(Sorbonne),“马可波罗”(Marcopolo),"曼妮莎”(Manissa),“康伽德奥”(Concad'0)5个品种为材料，采用综合脱毒技术，即将热处理、抗病毒药剂和茎尖培养相结合的方法。优化了脱毒百合种球组培培养基成分和培养程序，快速培养得到脱毒组培籽球，缩短了百合脱毒优质种球的快繁时间，同时籽球的定植成活率较高。本发明易于在切花百合原种的规模化快繁生产中推广应用。

本发明通过以下技术方案实现:

一种百合脱毒籽球的快速培养方法方法，按如下步骤进行:

(1)百合种球的栽种:在35-38℃条件下种植百合种球，栽种后经7-15天的培养，待芽长高叶集生茎的中部形似莲座状。

(2)外植体灭菌和生长点的剥取:采集步骤(1)的百合茎尖，用中性肥皂水清洗3-5分钟，自来水冲洗过夜，0.1%升汞灭菌5-10分钟，然后在70%酒精浸泡10-15秒。取出茎尖，先用加吐温灭菌水冲洗2-3分钟，再用灭菌水冲洗5-6遍。外植体清洗干净后，开始剥取生长点，先将茎尖的叶片全部剥除，用解剖针挑取百合茎尖生长点，生长点长度为0.4-0.8(mm)，将剥取的生长点作为组培培养外植体。

(3)脱毒培养:将步骤(3)剥取的外植体百合茎尖生长点接种到诱导培养基(1/2MS+6-BA1.0-2.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+4%蔗糖+琼脂粉6g/L(pH5.8))，经过40-60天培养，生长点膨大成直径2-3cm的叶丛。②将叶丛切成0.5cm小块，接种于含病毒唑的培养基(MS+NAAO.2-0.5mg/L+4%蔗糖+病毒唑(Ribavirin)5-l0mg/L+琼脂粉5g/L+O.5%活性炭(pH5.8))，经过40-60天培养，形成带球的瓶苗。

(4)病毒检测:将步骤②瓶苗进行酶联免疫吸附测定实验(ELISA)和RT-PCR检测，确认无百合无症病毒(LSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和百合斑驳病毒(LMoV)病毒。

(5)脱毒籽球诱导培养:将步骤②经过病毒检测无病毒脱毒瓶苗转移到籽球诱导培养基(MS+KT2-5mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+4%蔗糖+琼脂粉5g/L+O.5%活性炭(pH5.8))，在温度22士1℃，光照强度1500Lx，光照12h/d的环境条件下培养40-60d，直接诱导出脱毒籽球。

(6)增殖培养:将步骤(4)组培籽球，切去叶片和部分基部组织后，纵切成3-4块直径0.3-0.5cm材料，接种于和籽球诱导培养相同的培养基上，在温度22士1℃，光照12h/d，光照强度1000-1500Lx的环境条件下培养2个月，可以扩繁3-4倍。